如何使用Coral Life（活细胞光电联用）改进活细胞成像

对于 Coral Life，已经配置了优化的光学显微镜系统，可以满足活细胞CLEM实验的所有需求：

1. THUNDER Imager Nano 以倒置显微镜为基础，可进行浸入式成像，而不会有浸入式物镜污染样品的风险。
2. THUNDER Imager Nano 是一款易于使用的仪器，即使对于非专业人员也能提供高性能的图像数据。
3. 该系统使用高灵敏度的 sCMOS 荧光摄像机，可以每秒 90 帧的速度捕捉活体事件。因此，您的活细胞 CLEM 实验可从以下优势中获益：
   • 以所需的放大率和分辨率快速获取整个直径 6 毫米蓝宝石基底的概览像素格图像。例如，使用 40x/1.1 NA 物镜可对整个蓝宝石基底进行 468 次曝光。使用 2 个通道（透射光和发射荧光）进行同样的采集大约需要 3 分钟。使用这种方法，用眼睛手动扫描合适的区域就变得不那么重要了。
   • 可以捕捉到快速的细胞事件，以便随后用冷冻电子显微镜进行检查。
4. 受益于徕卡创新技术 "计算清除"，这是THUNDER成像仪系统的一部分。它能有效消除离焦模糊，准确定位感兴趣的蛋白质或细胞结构，以便进行下一步的超微结构分析。

为了将活细胞成像与高压冷冻固定结合起来，我们用蓝宝石盘取代了标准玻璃基底，以避免细胞基底在 2000 巴的诱导压力下破裂。对于活细胞光电连用，我们使用直径 6 毫米、厚度 120 微米的蓝宝石盘。遗憾的是，不能使用标准的玻璃校正物镜，因为蓝宝石玻璃在可见光发射范围内会产生 80 纳米的色差。为了优化使用蓝宝石基底的活细胞成像，徕卡显微系统公司开发了一种用于水浸的 40x/1.1 NA 蓝宝石校正物镜。该物镜消除了蓝宝石引起的色差，同时具有与相应玻璃物镜相同的透射性能。此外，该物镜还配有一个电动校正环，用于补偿蓝宝石的厚度变化。

要精确识别和解析目标事件，就必须获得最佳图像质量。遗憾的是，在传统的宽场系统中，可以观察到主要来自焦外区域的背景噪声，这大大降低了对比度和识别感兴趣结构的能力。

为了解决这个问题，徕卡显微系统公司开发了THUNDER技术，能够消除焦外模糊。这项技术可以精确定位感兴趣的结构，以便进行后续的超微结构分析。

尤其是生物样本，背景通常不会在整个宽场图像中保持不变。在整个视野中，背景可能会有很大的变化。计算清除会自动考虑到这一点，使聚焦内的信号立即显现出来。

THUNDER成像仪有三种模式可供选择：

• 即时计算清除 (ICC)
• 小容量计算清除 (SVCC)
• 大容量计算清除 (LVCC)

ICC 相当于上述的计算清除。SVCC 和 LVCC 是计算清除和基于决策掩模的三维解卷积的组合，专门用于薄样本（SVCC）或厚样本（LVCC）。去卷积方法的自适应图像信息提取遵循的是一种从 LIGHTNING（徕卡微系统公司最初为共聚焦显微镜开发的自适应去卷积方法）发展而来的概念。

下面将展示THUNDER技术在使用蓝宝石玻璃作为不同类型样品的基底时的效果。所有样品均使用 40x/1.1 NA 蓝宝石校正水浸物镜成像。第一个样品是 Hela 细胞系，红色突出 DNA，绿色突出微管。任务是跟踪有丝分裂和细胞分裂的不同阶段，分析有丝分裂纺锤体的重建情况。由于固有的背景模糊，对目标结构进行适当的结构分析和识别变得更加困难。应用 THUNDER 和 SVCC 后，背景噪音得以消除，固有的图像信息得以展现。

不仅可以对细胞进行成像和处理，还可以对果蝇或线虫等较厚的组织样本进行成像和处理。下一个示例显示的是用中心粒标记物（绿色）（即中心粒周围物质的蛋白质 SPD-5）标记的秀丽隐杆线虫胚胎。在这里，我们以间期非分裂细胞中的中心粒为靶标。在间期，中心粒-GFP 信号较暗，因此很难从背景中识别和区分。通过使用THUNDER技术，特别是 LVCC，可以消除固有的模糊，获得识别和锁定这些微小、暗淡结构的最佳条件（图 3）。

为了强调 LVCC 对较厚样本的优势，我们对果蝇胚胎进行了研究。用 Ana-2-GFP 标记中心粒，以观察中心粒的同步分裂。目的是在 电镜中创建中心粒分裂的时间表。为实现这一目标，正确跟踪和解析中心粒至关重要。由于蛋壳的荧光背景较高，中心信号不容易被检测到。图像经过 ICC 和 LVCC 处理后，去除了蛋壳的背景荧光并突出中心粒。

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