工作流程与协议：如何使用激光显微切割技术分离单个染色体

Schlaudraff, Falk

十二月 03, 2015

工作流程与协议：如何使用激光显微切割技术分离单个染色体

关于在巴西举行的徕卡 LMD 用户研讨会的报告

在巴西举行的第一次徕卡研讨会上，参与者学习了如何使用冷冻切片机准备激光显微切割样本 Centro de Energia Nuclear na Agricultura/USP (CENA) 。另一个主题是从染色体扩展中解剖单个染色体。

徕卡专家以LMD激光显微切割进行了简短的培训课程。之后，新的LMD用户能够操作系统，并练习如何解剖染色体并收集单个染色体以进行后续分析。

使用冷冻切片机制备激光显微切割标本

激光微切割的样本准备比常规显微镜更复杂：组织的内容需要保护，以防降解和改变。此外，使用的固定剂和染料不应影响下游分析。因此，新鲜冷冻组织是首选，特别是对于 RNA 下游分析：新鲜材料提供最高的起始质量和特殊的固定协议。染色程序将在整个上游过程中保持这种高 RNA 质量，并且 UV laser microdissection process has no impact on the RNA quality。

图 1, 2：徕卡显微系统的产品经理Falk Schlaudraff（中，左）解释了如何使用徕卡冷冻切片机进行新鲜冷冻组织的激光微切割样本准备。

LMD 的染色体扩展准备

除了为 RNA 下游分析准备和解剖组织外，还希望进行 DNA 分析（例如，突变检测）。由于单个细胞通常包含两对染色体，因此单个染色体的分离对于染色体特异性疾病以及理解基因结构和不同物种中基因的贡献尤为重要。

使用徕卡LMD 激光显微切割系统和 150 倍干物镜结合 POL 框架载玻片，单个染色体的分离非常简单。步骤 1：需要在 POL 框架载玻片上准备染色体扩展。徕卡LMD协议指南提供了针对人类血液中白细胞样本准备的协议（由荷兰奈梅亨大学医学中心病理学系的Henry Dijkman博士提供）。

激光微切割的染色体扩展准备协议步骤：

细胞培养 72 到 96 小时。
培养液用秋水仙碱处理 1 小时。
培养物用低渗溶液处理 10-12 分钟。
洗涤步骤和细胞在甲醇/醋酸（3 + 1，v/v）中的固定。
固定的细胞被滴在 POL FrameSlide 上，并在空气中干燥过夜。
吉姆萨染色液应用 3 分钟。
经过再次在水中洗涤后，载玻片被空气干燥。
幻灯片已安装到 Leica LMD系统，并创建了低倍放大下的样本概览，以便更容易识别扩展。
使用 150 倍物镜对扩展进行详细可视化。
清理感兴趣的染色体周围区域（移动+切割或绘制+扫描模式）。
选择感兴趣的染色体的收集装置，并使用合适的激光设置进行解剖。

这段短视频展示了一位新的LMD激光显微切割用户如何在徕卡专家的指导下练习解剖染色体：

收集单个染色体后的棘手工作开始，因为分析和扩增如此少量的材料并不容易。然而，像 Qiagen Repli-G 试剂盒这样的商业工具可以帮助应对这一挑战。“正如在此次活动中证明的那样，收集染色体本身是可行的，并且易于学习，”Falk说。“此外，使用徕卡LMD系统也很有趣，因为它提供的功能远不止于观察切片。”