白激光

经典激光源通常仅提供单一的窄带发射。有些气体激光器可以同时发射几种光线。最著名的例子是氩离子激光器，在蓝绿范围内可以提供5条光线。其他激光器，例如染料激光器，虽然可以调谐，但一次仅能发射一种颜色。此外，染料激光器非常不稳定，需要一些耐心才能保持正常运行。有些固体激光器虽然可以调谐，但仅适用红外波段（例如：Ti:Sa激光器）。除了精密度高和价格昂贵之外，他们同样一次仅能发射单一波长的光线，而且调谐流程非常缓慢（需要好几秒）。

随着白激光的诞生，情况已经完全改变，因为它们可以在很大的波段范围内同时发射，而且在聚焦性能方面仍保持着激光的特性[1]。

这些光源采用光纤式红外激光器，发射约80兆赫的光脉冲。这种化合物称为“种子”，即提供精确的时钟，但能量比较低。脉冲随后在采用二极管泵浦的激光放大器中放大。放大激光器同样基于光纤，且两个系统通过光纤拼接无缝耦合。该放大器的输出红外激光可以达到大约10瓦的平均功率，在80兆赫时，脉宽大约200ps。这些高能脉冲最终聚焦在所谓光子晶体光纤（PCF）的入口表面。这些光纤的主要特征是其中心位置有空心管的图案。这种空心管图案表面的强烈非线性处理，包括群速色散（4阶）、自陡峭、拉曼散射和等离子裂变，导致单色光线扩散到更为广阔的光谱范围，达到蓝色，甚至紫外谱段。

根据PCF的长度，单色红外波峰可以横跨数百纳米的光谱。典型光纤长度为0.5到2米。

与使用白色光源进行荧光照明的其他显微镜一样，白激光共聚焦显微镜[2]需要一种方式选择激发波长以激发不同的荧光染料。如有可能，多个激发波长能够同时激发多重染色样品更好。在宽场荧光显微镜中，这项工作由激发滤片执行。具有三到四段带通的二向色镜可以用于多重染色样品。

超连续谱中发出的光束可以提供更加全面的解决方案。声光调制滤片可以从光谱中挑选一条谱线（实际上是窄条带波）并将其偏转到不同的方向。光谱的其他部分直接穿过水晶。条带波的波长可以无极调谐，条带的宽度大约1到3纳米，具体宽度取决于其波长。 此类条带波的能量一般是几毫瓦，但已经足以用于成像，甚至经常用于FRAP实验。通过增加更多电子驱动器以便在晶体中产生机械波，同时可以输出一系列颜色，最多可以同时产生八种波长的激发光（但并非技术上限）。这些条带波的波长和强度均可调谐。

这一组合令白激光（WLL）成为共聚焦显微镜的理想光源。它适用于可见光范围内所有已知的可激发染料，并且可以记录激发光谱来探索新染料的光谱性质，尤其是原位光谱。此外，如果出于发射收集的原因或者为了改善相邻染料的分离，它可以任意调谐以实现峰外激发。

光谱检测器（SP）旨在对检测到的发射波段的带宽以及中心波长实现完全控制。这可以保证更高的通量（传输效率）以及优化分离。除此之外，光谱检测器还可以记录发射光谱，不论是同时扫描（5通道）还是序列扫描（最多400个频道），也可以是二者结合。过去，发射光谱与安装在系统中的固定谱线激光器绑定在一起。有了白激光（WLL），这种情况完全改变了：由于颜色可以按照1纳米的精度调谐，整个可见光谱内都可获得平滑的激发光谱。结合可以自动控制匹配激发波长的光谱检测器，这项测量工作可以完全自动进行。且这项工作只有通过声光分光器来引导激发光和发射光才可以实现。

同时获取了可调谐激发和可调谐发射之后，下一步是创建有关强度的二维关系图[4]。需要分离复杂的荧光染料混合物时，这种λ平方图尤其有用。当需要对荧光染料的特性进行研究时，它同样具有普遍的价值：无论是因为他们是新发现或新设计的，还是是因为对微环境条件引起的光谱变化。

荧光由发射强度和荧光寿命来表征。为精确衡量荧光寿命，需要脉冲光源。幸运的是，白激光是一种脉冲光源，且脉冲频率符合典型荧光寿命的要求（即在0.5到5纳秒的范围内）。如果需要更长的脉冲间隔，也可以降低脉冲频率。当然，白激光的可调谐性可以直接显示荧光寿命激发光谱，这包括下一个逻辑结果：二维激发-发射寿命图。

最后，这项最新技术还实现了一项功能。混合检测器（HyD）拥有灵敏度高、速度快，动态范围大等特点。它还提供一种门控操作模式。通过与脉冲白激光结合，混合检测器可以在光脉冲之间的时间内检测荧光发射：只需设置HyD的门控时间以便在激光脉冲期间不收集信号。检测到的信号只包含纯荧光信号，并且不含任何反射光。通过这种方法，荧光颜色在与残留反光的对抗时可以轻松获胜。不需要通过为激发波长留出足够的空间来限制发射收集。甚至有可能紧接着激发波长之前以及更远的位置进行测量，这样就可以表征反斯托克斯发射。

脉冲和可调谐光谱白激光光源，与可调谐声光分光器、可调谐光谱检测器以及门控混合检测器结合，是极具吸引力的新技术的融合。虽然下面这段听起来有点老套，但非常应景：它彻底改变了共聚焦显微镜的设计理念和操作。