在向导界面的顶部，各工作步骤显示成按钮：“Overview”（概述）、“Set Up”（设置）、“Bleach”（漂白）、“Time Course”（时间过程）、“Evaluation”（评价）（图2）。
“Overview”概述当中提供了向导的说明并解释了每一个步骤所应进行的操作。
成像
首先要描述具有放大功能的FRAP例行程序：
点击“Setup”设置按钮（见下图3）来为预光漂白和后光漂白调节硬件参数。
请注意：
在配备混合探测器（HyD）的TCS SP8系统上建议使用PMT作为FRAP实验的首选探测器。在光漂白过程中，感兴趣区域（ROI）内通常达到高强度水平，这可能导致HyD探测器关闭以保护其免受光子过载的影响。由于随后必须主动打开检测器，否则光漂白序列将丢失而且无法进行量化。
扫描模式
如果3D堆栈应当予以更加细致的分析，则可以将扫描模式从xyt变更为xyzt（图4）并分析一段时间内的整个z堆栈。然后在xyzt模式中对预光漂白和后光漂白序列进行扫描，堆栈内一个平面的光漂白可进行定义。
如果该选项已激活，则扩束器从光束路径上撤回。因此，物镜的后光圈不再完全充满光（见图9A）。进入物镜的光量是相同的，但集中在中心的一个点上，根据物镜的不同，光的强度大约要大2到5倍（见图9B）。事实上，使用FRAP加速器选项，可以用多种光强度（更集中的光与不集中的光）照亮。
针孔大小
处理较薄的细胞层时，您可以将针孔大小设为2个艾里单位或以上。将针孔打开可改善信噪比，且您将收集到样本更深入的动力学信息。
请注意：
将强度设置为低于饱和但略高于零，因为零值设置可能会干扰数据分析。适当的查找表（辉光上方/辉光下方）有助于调整增益/偏移。确保所有实验使用相同的增益设置。为了再现性，建议现在或最后一步保存（图10）设置、漂白和时间过程选项卡中的所有设置。然后所有硬件设置，包括ROI形状和位置等都将得到存储。
Flymode（飞行模式）①
为整个FRAP系列提供更快的时间分辨率。取代逐帧时间分辨率后可以实现逐行时间分辨率。您可以将时间分辨率降低到0.35 ms，因为恢复测量已经在行间而不是帧间完成。这一事实意味着恢复测量开始时尽可能接近零时（t0）。
FlyMode（飞行模式）结合了光漂白扫描和光漂白后的第一次图像扫描（图14）。光漂白在前进运动中使用感兴趣区扫描（）ROI）功能和高激光功率一起执行。在回扫期间，激光强度设置为成像值（AOTF开关以微秒为单位进行工作）。因此，与光漂白帧同时获取第一图像。所以，漂白和数据采集之间的延迟时间小于扫描一行所需时间的一半。
将背景设为零值 ④
启用“Zoom In”或“Flymode”时推荐该选项。
放大：
通常ROI外部区域会在背景强度下曝光。如果放大图像，这种背景强度会造成光漂白。使用“设置背景为零”，曝光的ROI外部区域将不会接收到光。
FlyMode：
FlyMode（飞行模式）处于活跃状态时，您会获得前进通道和回扫通道（见以上内容）。使用“将背景设为零值”时，前进通道将不会再预漂白和后漂白期间看到光线。只有在光漂白步骤期间，前进（左）通道才会有光进入到ROI内。
共振扫描模式下有效光漂白的预状态调节
如果需要非常快速的扫描模式（例如，测量水介质中的扩散），您可以采用512 × 128格式进行双向扫描，这会让每帧的时间变得非常短，即12 ms。这里建议应用多个光漂白帧，例如三个或四个，以应用足够的光进行光漂白。
因照明时间太短导致光照太少时可进行补偿，您可以使用：
- 光漂白期间的放大（使用TCS SP8系统，共振扫描头也可以提供放大）[FRAP可变焦距镜头]。
- 设置中的FRAP加速器选项。
步骤3：时间过程 – 定义预漂白、漂白和后漂白间期的数量
接下来选择时间过程（图15）来定义预漂白、漂白和后漂白间期的数量。1800 Hz扫描速度（双向扫描）的典型实验和256 × 256格式可以定义如下：
您也可以通过单击“+”来添加其他时间刻度。如果需要，实验可以在中途停止，例如在漂白后。然后将引导用户进入评估步骤。如果完全恢复的总时间未知，则此功能特别有用，因为该功能可允许用户在达到完全恢复（即强度不再增加）后立即在漂白期间结束实验。换句话说，不需要等到获得了预测的帧数。
| 帧数 | 最小时帧 | 每帧时间 [ms] |
预漂白 | 10 | 是 | 79 |
漂白 | 1 | 是 | 79 |
后漂白1 | 100 | 是 | 79 |
后漂白2 | 10 | 否 | 1000 |
后漂白3 | 10 | 否 | 5000 |
表1：预漂白、漂白和后漂白步骤中的总帧数和帧速参数。
