光激活、光转化和光控开关荧光蛋白

Greb, Christoph

五月 04, 2017

光激活、光转化和光控开关荧光蛋白

[Translate to chinese:] Dronpa chromophore Dronpa_chromophore.jpg

荧光蛋白（FP）如GFP、YFP或DsRed都是可视化观察活细胞中细胞组分的强大工具。尽管如此，目前仍然会有传统FP达到极限的情形发生。普通FP无法观察特定兴趣蛋白中专有、空间有限的蛋白质群体，因为它们在整个细胞中都有表达。此时，光激活、光转化和光控开关荧光蛋白就登上了舞台。荧光套件中的成员可以从非荧光状态激活，可以改变发射光谱，甚至可以逆转式地“开启和关闭”。借助这些“光学荧光笔”，研究人员可以通过激活特定波长的空间限定光束来转变荧光，从而追踪不同的蛋白质种群。

另一种值得注意的荧光蛋白是荧光计时器，这种蛋白能随时间改变发射波长。以下文章将概述这些特殊荧光蛋白的选择。

Authors

Christoph Greb , Dr.

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图1：通过蓝/紫色光谱的光刺激，光激活FP可从非荧光状态切换成“开启”荧光状态。光转化FP能够将自己的荧光发射光谱从一个最大值改变为另一个最大值。这种现象也可以通过特定波长下的曝光来触发。借助两种不同波长的光脉冲，光控开关FP可切换“开启和关闭”状态。该循环可执行高达数百次。

光激活蛋白

光激活蛋白可以从低荧光状态“切换开启”成更高的荧光状态。在紫/蓝光谱中使用短光脉冲后，开关切换就会在不到1秒时间内出现并可用于检测动态细胞过程。感兴趣区域（ROI）中分子的定向光激活可用于监测这些活化蛋白在细胞内的运动。但在其他的脉冲追踪实验装置如FRAP当中，人们无法区分重新进入ROI的蛋白质和新合成的分子，光激活是规避这个问题的方法之一。

第一个光激活蛋白是wtGFP变体，由Lippincott-Schwarz和Patterson创造。该蛋白含有一处单点突变（T203H），导致在450到550 nm范围内的吸光度非常低。PA-GFP（光激活绿色荧光蛋白）在紫光帮助下获得光激活，将其吸收最大值从400 nm切换到504 nm（见图2）。因此，当用488nm的波长激发时，其荧光增加约100倍，活化和未活化蛋白之间的强烈对比可以反映这种现象[1]。

图2：PA-GFP（光激活绿色荧光蛋白）可通过UV（紫外线）光激活从无荧光状态变为荧光状态。

PA-GFP活化的基本过程似乎是残基222中谷氨酸侧链的光诱导脱羧。脱羧改变了生色团的结构，从中性到阴离子状态[2]。

此处应提及的另一候选蛋白为Phamret（光激活介导共振能量传递），一种通过FRET进行光激活的特殊串联二聚体荧光蛋白。Phamret是一种融合蛋白，由一个PA-GFP与其FRET荧光对ECFP共价偶联而成。458nm波长下曝光会导致480nm处发射ECFP。PA-GFP的相邻光激活通过405nm激光束进行。之后在458nm下重复曝光导致出现了激发ECFP和PA-GFP之间的FRET并形成绿色荧光。因此，“未活化”和“活化”形式可以被相同的激光波长激发（如图3所示）。缺点可能是由两个荧光蛋白组成的蛋白质的大小，可能引起空间问题。

图3：Phamret（光激活介导共振能量传递）是由PA-GFP及其FRET荧光对ECFP组成的串联二聚体。初始于458nm下曝光会导致ECFP发出蓝色荧光。PA-GFP经UV（紫外光）光激活后于458nm下重复曝光会产生绿色荧光，因为两种蛋白质之间存在FRET。因此，Phamret原则上类似于光控开关蛋白，但只需要一条激光线就能激发两种不同的荧光状态。

值得注意的是，光激活蛋白通常会表现出一种弱于EGFP的亮度，而且光稳定性同样减弱（见表1）。

光转化蛋白

不同于光激活蛋白，光转化蛋白在未转变状态下就已经发出荧光。因此该蛋白可以更容易地界定的ROI。光转化作用在石化片脑纹珊瑚（大花脑珊瑚）当中发现。鉴于这种蛋白的发射特性，在UV（紫外线）光照的光转化后会从绿色变成红色，因此这种荧光蛋白又被叫做Kaede，就像枫叶一样[4]。这些树叶在秋天会从绿色变成红色。如果Kaede在 380到400 nm之间的波长内进行光转化，其发射最大值会从518 nm变为582 nm。红绿色荧光之间巨大的比值变化可以体现这一点，其中的系数高达2,000。这种转变不可逆（见图4）。另一个限制因素是Kaede的四聚体性质，这使得它很难用于活细胞成像研究。FP的寡聚可能导致人们误判标记的感兴趣蛋白（POI）的位置。聚合甚至可以完全抑制POI的正确功能。

光转化过程的基础是光诱导过程。在这种情况下，生色团（His61-Tyr63-Gly64）内的组氨酸残基通过辐射被裂解，并最终导致形成高度共轭的双咪唑环结构。这一过程与荧光向红色波长的转移有关[2]。

红绿色转变FP来自珊瑚属Dendronephtytha sp。该蛋白的名称和红色活化属性反映在表达式Dendra [5]中。Dendra2的商业开发就成为了首个单体红绿色光转化蛋白。

另一种广泛使用的荧光蛋白是tdEosFP [6, 8]，主要从石珊瑚（Labophyllia hemprichii）当中分离获得。串联二聚体在近紫外照射后可以从绿色荧光转化为红色荧光，基本都会用于超分辨率显微镜，单体版本 mEos和mEos2也是如此。

在第三种石珊瑚Favia favus中发现了一种与Keade特征非常相似的光转化蛋白。近紫外照射后，四聚体KikGR的荧光由绿色变为红色，但都比Kaede亮得多。它的商业变体被称为Kikume，可以通过750nm波长的多光子激发进行光转换。像这样的蛋白可以用于厚组织标本。KikGR的突变导致单体形式mKikGR。与mEos2和Dendra2一起，这种蛋白成了超分辨率成像常用的荧光蛋白。

光控开关蛋白

光激活是从非荧光状态到荧光状态的不可逆转换，而光开关蛋白能够在这两种状态之间穿梭[7]。在不同波长光脉冲的帮助下，这些荧光蛋白可以开关几百次而不发生光漂白。这种在荧光态和暗态之间切换的现象称为光致变色，并且已经在wtGFP的单分子水平上出现，尽管程度很低。

用于超分辨率显微镜成像的一种比较知名的光控开关蛋白衍生自石珊瑚，Dronpa，一种单体，由于其阴离子脱质体生色团，在503nm处有一个吸收最大值，由于其中性质子化生色团，在390nm处有一个较小的吸收最大值（见图5）。阴离子型在518nm处发射最大，而中性型为非荧光状态。

图5：Dronpa的荧光发射可以可逆地打开和关闭。用488nm光激发产生绿色荧光，其衰减较快。随后用UV（紫外线）光照射可重新激活荧光状态。

此外还有一种顺反异构化与生色团的质子化有关。在生色团中性状态下，Tyr66为反式构象（见图6）。在阴离子状态下，Tyr66具有顺式构象。当用405nm激光脉冲照射时，Dronpa被迫进入其荧光顺式构象。488nm的激光脉冲将Dronpa构象转换为非荧光反式。这个循环可以重复几百次。

图6：Dronpa生色团的Tyr66侧链在光控开关期间经历顺反异构化。当反式构象是非荧光构象时，顺式构象发射荧光。

四聚体式光控开关蛋白，红色区域内发射最大为Kindling FP（KFP1）。

最新的研究是要打造一种新型光学荧光灯，可以将光转换和光控开关结合起来。IrisFP是一种wtEosFP衍生物，在其绿色荧光和红色荧光构象中具有开关状态。换言之，在用高强度405nm激光束照射时，IrisFP从其绿色发射状态转移到红色发射状态。绿色IrisFP可以在488nm激光的帮助下关闭。405nm的低强度激光再次开启。另一方面，红色IrisFP用532nm激光关闭，用440nm激光再次打开。单体形式mIrisFP的相邻结构为进一步的应用打开了大门[3]。

IrisFP结合了光转化和光控开关。适当的触发波长和强度的选择在荧光和非荧光状态之间切换，又或者将蛋白质的发射从绿色波长转换为红色波长。

其他特殊荧光蛋白

除了荧光蛋白易受光的操纵外，还有其他蛋白质可通过进一步的触发物进行转换（见图8）。例如，对活细胞离子状态感兴趣的研究人员可以选择GCaMP作为钙离子指示剂。GCaMP的荧光行为取决于其与Ca2+的结合。其他荧光蛋白如VSFP1可用于检测膜电位，而黄色荧光蛋白YFP-H148Q对氯离子敏感。此外，FPs的荧光特性随环境pH值的变化而变化。Superecliptic pHluorin（SEP）和pHuji就是两个例子。在此帮助下，胞内和胞外反应以及胞内分选可以获得追踪。

荧光蛋白随着时间改变其发射光谱称为荧光计时器。这种不是pH值变化、离子强度或蛋白质浓度的结果，而是独立于这些生化参数而发生的。换句话说，相关蛋白质的年龄可以通过其颜色来估计。有了这些特性，就有可能测量活细胞内的时间和依赖时间的事件。

图8：离子敏感荧光蛋白在结合例如钙离子时改变其荧光行为，而pH敏感荧光蛋白如pHuji在特定pH范围内显示出极大的荧光强度增加。荧光计时器正随时间改变其发射光谱。在此帮助下可将年龄和蛋白质的细胞位置联系起来。

第一个荧光计时器是由Sergey A. Lukyanov 实验室在2000年报道。这种被命名为FT（荧光计时器）的DsRed突变体在18小时内将其发射光谱从红色波长改变为绿色波长。由于FT是四聚体，Vladislav Verkhusha认为有必要创建单体的荧光计时器。Mchery的突变导致3个以上的荧光计时器具有不同的转化时间（见表1）。这些蛋白质在快、中、慢的时间尺度上从蓝色变为红色，但仍然太慢，无法测量几分钟内发生的细胞过程。

尽管如此，在荧光计时器的帮助下我们依然可以通过空间和时间分辨率来观察活细胞内的蛋白质活动。此外，蛋白质转运或病毒组装可以跟踪或基因表达可以监测。该应用列表肯定可以扩展，而且会呈现出荧光计时器的潜在用途。

表1：选定的光激活、光转化和光控开关蛋白以及荧光计时器

蛋白	Ex_max(nm)	Em_max(nm)	QY	亮度	pK_a	结构	其他
光激活蛋白							活化条件
PA-GFP	400 504	515 517	0.13 0.79	2.7 14		单体	violet
PAmCherry	404 564	ND 595	ND 0.46	8	6.3	单体	350 – 400 nm
PATagRFP	ND 562	ND 595	ND 0.38	ND 25.1	ND 5.3	单体	紫色
PAmKate	ND 586	ND 628	ND 0.18	ND 4.5	ND 5.6		405 nm
Phamret (PA-GFP + ECFP)	458 458	475 517	0.40 0.79	13 14		单体	紫色
光转化蛋白							转化条件
mClavGR2	488 566	504 583	0.77 0.53	14.6 17	8 7.3	单体	405 nm
mMaple	489 566	505 583	0.74 0.56	11.1 16.8	8.2 7.3	单体	380 nm
Dendra2	490 553	507 573	0.50 0.55	22 19	6.6 6.9	单体	初始状态紫色
PS-CFP2	400 490	468 511	0.2 0.23	8.6 10.8		单体	紫色
Meos3.2	507 572	516 580	0.7 0.55	53 18	5.4 5.8	单体	405 nm
Kaede	508 572	518 580	0.88 0.33	87 20	5.6 5.6	四聚体	初始状态紫色
EosFP	506 571	516 581	0.7 0.55			四聚体
mEosFP	505 569	516 581	0.64 0.62			单体
mEos2	506 573	519 584	0.84 0.55	47 30	5.6 6.4	单体	初始状态紫色
kikGR (Kikume)	507 583	517 593	0.7 0.65	37.6 22.8	7.8 5.5	四聚体	365 nm
PSmOrange	548 636	565 662	0.51 0.28	58 9	6.2 5.6	单体	蓝绿
PSmOrange2	546 619	561 651	0.61 0.38	31.1 7.2	6.6 5.4	单体	489 nm
mKikGR	505 580	515 591	0.69 0.63	34 18	ND ND	单体	初始状态紫色
光控开关蛋白							活化/淬火条件
mTFP0.7	453	488	0.5			单体	405 nm / 458 nm
PDM1-4	503	517					405 nm / 488 nm
Dronpa	503	518	0.85	80.8	5.0	单体	紫色/蓝色
Dronpa-2	489	515	0.28			单体	405 nm / 488 nm
Dronpa-3	489	515	0.33			单体	405 nm / 488 nm
bsDronpa	460	504	0.5			单体	405 nm / 488 nm
Padron	503	522	0.64			单体	503 nm / 405 nm
Padron0.9	500	524					500 nm / 400 nm
Mut2Q	496	507	0.28			单体	405 nm / 478 nm
rsFastLime (DronpaV157G)	496	518	0.77			单体	405 nm / 488 nm
rsKame (DronpaV157L)	503	518	0.86
Dreiklang	515	529	0.41	34	7.2	单体	365 nm / 405 nm
mGeos-M	503	514	0.85	43.9	4.5-5	单体	405 nm / 488 nm
EYQ1	510	524	0.72			单体	405 nm / 514 nm
KFP1	590	600	0.07			四聚体	532 nm / 458 nm
rsCherry	572	610	0.02			单体	550 nm / 450 nm
rsCherryRev	572	608	0.005			单体	450 nm / 550 nm
rsTagRFP	567	585	0.11			单体	445 nm / 570 nm
mApple	568	592	0.49			单体	480 nm / 570 nm
asFP595	572	595	<0.001			四聚体	569 nm / 450 nm
Kindling FP (KFP1)	580	600	0.07	4.1	ND	四聚体	绿色 / 450 nm
rseGFP	493	510	0.36	16.9	6.5	单体	405 nm / 488 nm
rseGFP2	478	503	0.3	18.4	5.8	单体	408 nm / 478 nm
Photoconvertible/ Photoswitchable proteins
IrisFP	488 551	516 580	0.43 0.47	22 17		四聚体
mIrisFP	486 546	516 578	0.54 0.59	25 19	5.4 7.6	单体	紫色（黑至绿）青色（红至黑）紫色（绿至红）
荧光计时器							过渡时间(h)
Slow-FT	402 583	465 604	0.35 0.05	12 4	2.6 4.6	单体	9.8 28
Medium-FT	401 579	464 600	0.41 0.08	18 6	2.7 4.7	单体	1.2 3.9
Fast-FT	403 583	466 606	0.30 0.09	15 7	2.8 4.1	单体	0.25 7.1
mK-Go	500 548	509 561	ND ND	ND ND	6.0 4.8	单体	10

Exmax: 激发最大值，Emmax: 发射最大值，QY: 量子场，亮度用量子场和摩尔激发系数的乘积除以1,000来进行计算

参考文献

1. Diaspro A, Testa I, Caorsi V, Mazza D, Vicidomini G, Barozzi S, Parazzoli D, Transidico P, Garrè M and Faretta M: 4D Photoactivation of pa-GFP in Living Cells Using Two-Photon Excitation Laser Scanning Microscopy.

2. Olesya V, Stepanenko O, Stepanenko V, Shcherbakova DM, Kuznetsova IM, Turoverov KK and Verkhusha VV: Modern fluorescent proteins: from chromophore formation to novel intracellular applications. BioTechniques 51 (2011) 313–327.

3. Wu B, Piatkevich KD, Lionnet T, Singer RH and Verkhusha VV: Modern fluorescent proteins and imaging technologies to study gene expression, nuclear localization, and dynamics. CurrOpin Cell Biol 23:3 (2011) 310–317.

4. Ando R, Hama H, Yamamoto-Hino M, Mizuno H and Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 99:20 (2002) 12651–6.

5. Gurskaya NG, Verkhusha VV, Shcheglov AS, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Lukyanov S and Lukyanov KA. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol 24:4 (2006) 461–5. Epub 2006 Mar 19.

6. Wiedenmann J, Ivanchenko S, Oswald F, Schmitt F, Röcker C, Salih A, Spindler KD, Nienhaus GU. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci USA. 101:45 (2004) 15905–10. Epub 2004 Oct 25.

7. Zhou X and Lin MZ: Photoswitchable Fluorescent Proteins: Ten Years of Colorful Chemistry and Exciting Applications. Curr Opin Chem Biol. 2013 Aug; 17(4): 682–690.

8. Jörg Wiedenmann, Sergey Ivanchenko, Franz Oswald, Florian Schmitt, Carlheinz Röcker, Anya Salih, Klaus-Dieter Spindler, and G. Ulrich Nienhaus: EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion

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