工作流程与协议:如何使用徕卡激光显微切割系统和 Qiagen 试剂盒进行成功的 RNA 分析

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激光显微切割(LMD) 允许分离单个细胞或染色体,是一种在下游分析核酸内容(通过 PCR 或测序技术)之前进行样本准备的成熟技术。在这里,我们描述了徕卡LMD系统与 Qiagen 试剂盒成功结合的过程,即使在少量样本中也能有效提取核酸。所呈现的工作流程和协议为成功的LMD应用提供了基础,确保在过程中不损失核酸数量,并保持 RNA 的完整性,突显了产品的高质量。

材料 - 实验室库存

徕卡 LMD激光显微切割系统

  • 冷冻切片机(例如徕卡 CM1850 UV)
  • 移液器 10–1,000 µl
  • 移液器 2–20 µl
  • 离心机用于管子
  • 镊子
  • 用于冷冻切片的镊子和刷子

材料 - 化学品和消耗品

Qiagen RNeasy Micro 试剂盒

  • 50 毫升的法尔肯管袋
  • 纯乙醇(EtOH),分子生物学级
  • 分子生物学级水
  • 克雷斯紫
  • 铝箔
  • 适用于LMD阶段收集器的 0.5 或 0.2 毫升薄壁 PCR 管,带平盖
  • 移液管尖(适用于 1 毫升移液管和 20 微升移液管)
  • 带无菌过滤嘴的注射器
  • 冷冻切片机刀片
  • 聚乙烯薄膜
  • 徕卡 LMD 切片(例如 4 µm PEN 框架)
  • 硅胶袋
  • Kimwipes

上游准备

1% 磷酸紫(CV)溶液在 100% 乙醇(EtOH)中:将 500 毫克磷酸紫粉末加入 50 毫升法尔肯管中,然后加入 100% 乙醇填满 50 毫升。应在使用前 1 周准备。将法尔肯管放入冰箱,覆盖铝箔(磷酸紫对光敏感),并每天轻轻摇晃。

用于固定和洗涤步骤的乙醇行:

  • 2 次 75% 乙醇:将 37.5 毫升乙醇倒入 50 毫升法尔肯管中,然后加入分子生物学级水至 50 毫升
  • 将一个 75% 乙醇的法尔肯管放入-20°C 冰箱
  • 95% 乙醇:将 47.5 毫升乙醇倒入 50 毫升法尔肯管中,然后加入分子生物学级水至 50 毫升
  • 100 % 乙醇 50 毫升乙醇倒入 50 毫升法尔肯管
  • 法尔肯管中的乙醇可以重复使用最多 3 天。

重要提示:

  • 用 Parafilm 密封法尔肯管以便存储 → 这将防止乙醇蒸发!
  • 将 LMD 切片放在 UV-C 光下 10 分钟 → 激活膜以提高切片粘附性并消毒表面!
  • 将 0.2 或 0.5 毫升的试管盖子打开,放在UV-C 光下至少 30 分钟 → 消毒并消除任何 RNA 和 RNase!
  • 准备三个 50 毫升的 Falcon 管,里面放一些硅胶袋 → 硅胶将保持载玻片和切片干燥,处理 RNA 时,湿度和水分是你的敌人,因为它们可能激活 RNase!

冷冻切片

将含有冷冻样本的块直接放入 Leica 冷冻切片机,从–80 °C 开始,至少在–19 °C 下平衡 30 分钟。

在平衡后,准备适当厚度的切片(厚度应根据感兴趣细胞的直径选择,本测试准备了 10 微米的切片)。

将一片(卷曲的)切片直接从冷冻状态放入 0.5 毫升的管中,并立即加入 350 微升 RLT 缓冲液(Qiagen Micro RNeasy 试剂盒的内容)。这将作为质量和数量的阳性对照。

图 4:用冷镊子收集的卷曲部分,直接转移到无菌管盖中。立即添加 350 µl RLT 缓冲液以保护 RNA 免受降解。

图 5:切片的准备和在 PEN 框架载玻片上的装载。冷冻切片会很容易融化到室温的膜上。

将载玻片与切片放入含 75%乙醇溶液的法尔康管中,温度为-20°C,浸泡 2 分钟(短暂固定)。2 分钟后,简要空气干燥载玻片,并将其存放在一个 50 毫升的法尔康管中,里面放一些硅胶袋(以保持干燥)。

用注射器通过无菌过滤嘴在另一部分和载玻片上重复此染色,但要添加一些 1%的 cresyl violet 溶液。将染色溶液在切片上放置 1 分钟。之后,将载玻片短暂浸入 75%乙醇、95%乙醇和最后的 100%乙醇中以洗去 cresyl violet。短暂空气干燥载玻片,并将其存放在一个 50 毫升的 Falcon 管中,里面放一些硅胶袋以保持干燥。

用另一部分和载玻片重复整个过程。

图 6:用注射器通过无菌过滤器将 cresyl violet 涂抹在载玻片上的切片上,持续 1 分钟。

图 7: 染色后的洗涤步骤:载玻片浸入逐渐升高的乙醇中以洗去剩余的 cresyl violet。

重要提示:

  • 将幻灯片存放在带有一些硅胶袋的法尔肯管中,并用 Parafilm 密封 → 硅胶将保持幻灯片和切片干燥,密封可以防止环境湿气!

将所有装有幻灯片的管子和法尔肯管放在冰上。在使用之前,让幻灯片在密封的法尔肯管中在室温下与LMD系统平衡 15 分钟。

LMD 测试幻灯片

你现在应该有:

  • 1 个装有 350 µl RLT 缓冲液的管子(阳性对照)
  • 一段固定在载玻片上的切片,使用乙醇固定,存放在一个 50 毫升的法尔肯管中,里面有硅胶袋
  • 两个载玻片上固定的切片,使用乙醇固定并用 CV 染色,存放在一个 50 毫升的法尔肯管中,里面有硅胶袋

图 8:缓冲液、试管、载玻片在法尔肯管中,75%乙醇从冰箱取出后放在冰上。

未染色切片的载玻片用作另一个对照。因此,直接用 RLT 缓冲液从膜上消化,并转移到 0.5 毫升的管中(RLT 缓冲液的总量必须为 350 微升,不要将其全部用于从载玻片上消化,因为这会冲洗掉载玻片!)。

固定并染色的切片之一用作另一个对照。因此,直接用 RLT 缓冲液从膜上消化,并转移到 0.5 毫升的管中(RLT 缓冲液的总量必须为 350 微升,不要将其全部用于从载玻片上消化,因为这会冲洗掉载玻片!)。

徕卡LMD激光显微切割 系统用于 RNA 分析

剩余的固定和染色切片用于LMD。因此,将切片放入样本架中,并在收集架中放入一个 0.5 毫升的管子。选择已加载收集器的位置,并使用 LMD 软件 标记整个切片进行解剖,使用所需的放大倍数。启动激光,并在解剖后检查所有切片是否已收集在收集管中。如有必要,使用 Move+Cut 重新切割切片,以确保所有切片都被收集。

卸下收集管,小心地关闭盖子并简要离心解剖物。打开盖子,加入 350 µl RLT 缓冲液(在切割之前可以向收集盖中添加最多 65 µl RLT 缓冲液)。

图 9:带有固定和染色切片的 PEN 框架切片已加载到LMD系统中。

加载另一个收集帽,并在收集区域附近解剖空膜(大约相同的面积大小,以µm²为单位)。卸下收集管,小心关闭盖子并简要离心解剖物。打开盖子,加入 350 µl RLT 缓冲液(在切割之前可以向收集帽中添加最多 65 µl RLT 缓冲液)。该管将作为后续的LMD阴性对照。

图 10:在选择的放大倍数下,将切片逐片解剖到一个无菌管盖中。

图 11:标记区域和解剖结果易于可视化:左侧 = 切割线,中心 = 解剖区域,右侧 = 收集管盖中的解剖物。

重要提示:

  • 在捕获后,可以直接向收集管盖中施加最多 65 µl RLT 缓冲液,以保护解剖物的内容物免于降解

图 12:在低倍放大下收集的解剖样本肉眼可见(使用 5 倍物镜获得的解剖样本示例)。

激光微切割后的准备和处理

  • 向含有 RPE 的瓶子中添加 44 毫升,并勾选复选框以确保添加了 EtOH。
  • 准备 70% EtOH 溶液:向 50 毫升的 Falcon 管中添加 35 毫升 100% EtOH,并添加 15 毫升分子生物学级水。
  • 准备 80% EtOH 溶液:向 50 毫升的 Falcon 管中添加 40 毫升 100% EtOH,并添加 10 毫升分子生物学级水。

图 13:使用 Qiagen RNeasy® Micro 试剂盒的轻微修改协议进行 RNA 提取。

使用 Qiagen Micro 试剂盒提取 RNA,按照以下稍微修改的协议:

1.准备好所有试管。

2.向每个试管中添加 350 µl 70% EtOH(如有必要,在添加 350 µl 70% EtOH 之前转移到另一个合适体积的试管中),小心用移液器混合并直接转移到红色离心柱中。

重要提示: 

350 µl 应分成 100 和 250 µl,以免超过 0.5 ml 管的容量。混合可以直接在柱子上进行。

3.以 10,000 rpm 旋转 15 秒。

图 14:缓冲液被施加到 Qiagen RNeasy® 旋转柱上。

4.丢弃流出液并添加 350 µl RW1 以清洗柱子。

5.以 10,000 转/分钟旋转 15 秒。

图 15:离心机中的柱子准备就绪。

6.丢弃流出液,将柱子放入新的 2 毫升管中,并添加 500 微升 RPE(之前添加了乙醇)以清洗柱子。

7.以 10,000 转/分钟旋转 15 秒。

8.丢弃流出液并添加 500 微升 80%乙醇以清洗柱子。

9.以 13,000 转/分钟旋转 2 分钟

10.丢弃流出液,将柱子放入一个新的 2 毫升试管中

11.以最大速度旋转 5 分钟,盖子打开,以干燥柱子的硅胶膜

12.在 14 微升水中洗脱:小心地将 14 微升无 RNA 酶水移液到柱膜的中间,并将柱子放入一个新的标记好的 1.5 毫升试管中

图 16:14 微升无 RNA 酶水轻轻地应用到柱子的中间,以洗脱提取的 RNA。

13.以 13,000 转/分钟旋转 1 分钟

14.小心地将流出液重新移液到柱膜的中间

15.以 13,000 转/分钟旋转 2 分钟

洗脱液应储存于–80 °C,或如果可能,立即用于质量和数量的评估。

简要协议摘要

样本:

A – 直接从冷冻样本中提取的样本(整体阳性对照)
B – 固定样本,通过移液管提取(阳性对照,乙醇固定的影响)
C – 固定并染色的样本,通过移液管提取(阳性对照,乙醇固定和染色的影响)
D – 固定并染色的样本,通过LMD收集(LMD的影响)
E – 收集在样本旁边的空膜(LMD 过程/污染的阴性对照)
F – RLT 缓冲液下游纯化的阴性对照

 

使用 Qiagen Micro 试剂盒提取的 RNA:

  1. 添加 350 µl RLT 缓冲液
  2. 添加 350 µl 70%乙醇,用移液器混合并直接转移到柱中
  3. 旋转 15 秒,10,000 转/分钟
  4. 丢弃流出液并用 350 µl RW1 洗涤
  5. 旋转 15 秒,10,000 转/分钟
  6. 丢弃流出液并用 500 µl RPE(添加了乙醇)
  7. 旋转 15 秒,10,000 转/分钟
  8. 丢弃流出液并用 500 µl 80%乙醇洗涤
  9. 离心 2 分钟,10,000 转/分钟
  10. 丢弃流出液
  11. 离心 2 分钟,最大速度,盖子打开以干燥膜
  12. 用 14 µl 水洗脱*
  13. 旋转 1 分钟,满速
  14. 使用洗脱液并将其放回柱中
  15. 旋转 1 分钟,满速

结果

RIN®28S/18S
(高度)
28S/18S
(区域)
浓度
(ng/µl)
样本描述警报观察总 RNA 区域rRNA 区域
A0137  梯子
A17.41.41.969.1A  2.790.61
B17.11.31.984.5B  3.410.76
C17.31.42.0127C  5.131.26
D17.21.02.083.6D  3.380.78
E16.50.40.4110E  4.440.98
D96.90.70.967.3D  2.680.59
C27.36K!RNA 浓度超出 RINe 推荐范围0.30
D26.57L!RNA 浓度超出 RINe 推荐范围0.27
样本名称材料日期时间A260 浓度 (ng/ul)A260 (10 mm)A280 (10 mm)A260/A280A260/A230
blank_6RNA11.12.2014######000
ARNA11.12.2014######32.420.810.411.980.13
BRNA11.12.2014######48.181.20.582.070.1
CRNA11.12.2014######71.011.780.8921.51
DRNA11.12.2014######48.321.210.542.240.03
ERNA11.12.2014######64.651.620.732.20.06
DRNA10.12.2014######41.791.040.472.230.03
KRNA11.12.2014######1.720.040.021.970.02
LRNA11.12.2014######0.740.020.012.910.02

质量

所有样本(A–D)在不同处理下的质量几乎相同(RIN 7.1–7.4)。没有发现对 EtOH 固定、染色和 Leica LMD 解剖的影响。

将切片在 Parafilm 密封的 50 毫升 Falcon 管中冷冻储存于–80 °C 过夜,逐步在–20 °C 冰箱中解冻 20 分钟,在 4 °C 冰箱中解冻 20 分钟,然后在室温下解冻 15 分钟,重新打开 Falcon 管后,Leica LMD 解剖的结果也相当可比(样本 E1&D9,RIN 6.9 和 6.5)。

所有阴性对照均为空。

数量

所有样本(A–D)在不同处理下几乎具有相同的数量,只有样本 C(固定、染色并直接从载玻片上挑选)显示出比阳性对照(样本 A)更高的数量。未检测到乙醇固定、染色或 Leica LMD 解剖的影响。

将载玻片在密封的 50 毫升 Falcon 管中冷冻储存于–80 °C 过夜,随后在–20 °C 冰箱中逐步解冻 20 分钟,在 4 °C 冰箱中 20 分钟,以及在室温下 15 分钟后重新打开 Falcon 管,导致在 Leica LMD 解剖后结果相当(样本 E1 和 D9,储存后数量略高)。

所有阴性对照均为空。

不同的测量方法导致不同的结果 → 测量的共同不准确性。

总结来说,这些数据清楚地表明工作流程不会影响 RNA 的质量或数量。

致谢

我由衷感谢 Randolph-Habecker 博士此次举办LMD激光显微切割研讨会。

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