DNA分子的可视化

随着新一代EM ACE600电子束蒸发器的出现，可以产生均质的、非常薄的和低粒度的电子透明碳层，用作吸附生物物体包括DNA分子、蛋白质或DNA-蛋白质复合物的载体。然后使用精确和可重现的阴影角对吸收在薄碳层上的单分子或大分子复合物进行阴影化，得到高对比度TEM图像。本文中应用的方案集中于电子束蒸发在DNA分子可视化中的应用，最初由苏黎世ETH研究所JoséSogo博士的实验室建立，随后实施，由苏黎世大学IMCR研究所的Massimo Lopes教授实验室改进并提供给科学界 [1]。由于该程序的详细信息已于近期更新[1]，我们将简要参考方案的关键步骤，添加与EM ACE600包衣机在这一定义明确且经过尝试的实验工作流程的竞赛中使用特定相关的实验详细信息。

本方案适用于纯化的DNA分子。适用于该程序的DNA样品必须完全不含蛋白质和RNA分子。通过该技术，可以根据两种形式DNA纤维的不同厚度区分双链(ds)DNA和单链(ss)DNA之间的差异（见下一段）。

方案的第一步

用甲酰胺和洗涤剂苄基二甲基烷基氯化铵(BAC)制备溶液中DNA分子的平衡混合物。使用特定的铺展程序将该混合物铺展在较大的水面上。 

方案的第二步

用400目铜TEM网格接触DNA分子的单分子膜，在该网格上沉积薄(4-8 nm)、均匀和低晶粒碳层（见下一段）。然后立即将TEM网格浸没到乙醇和乙酸双氧铀溶液中。

方案第三步

具有吸收DNA分子的碳网格受到8 nm铂的精确低角度旋转阴影。这是一种背景染色，将对dsDNA纤维的可视化特别有效。

高质量碳层和精确的低角度旋转阴影与铂的结合产生了DNA纤维的高质量TEM图像（见结果）。在这里描述的制备流程中，碳层是用EM ACE600涂层器在V2高等级云母片上创建的，然后漂浮在水面上，最后，沉积在400目铜网格上，没有任何额外的聚乙烯醇缩甲醛树脂层或其他支撑材料。用该程序创建的碳表面在DNA分子的吸收中具有高效率，不需要辉光放电。

在400目铜网格的碳表面上吸收的DNA分子用8 nm的铂进行精确的低角度旋转阴影。网格固定在GRID载物台上，用于EM ACE600的低角度旋转阴影。在这种情况下，设计了两种不同的工艺，并按顺序运行。在第一个过程中，用0.4 nm的铂以1°的涂层角度覆盖网格上的碳表面，而不旋转GRID载物台。在第二个过程中，以相同的涂层角度沉积7.6 nm的铂，但将GRID载物台的转速设定为1级。

设定蒸发参数（主要是蒸发功率）非常重要，以使蒸发速度保持在一致性值（0.03-0.08 nm/秒），这对于碳层的生产和铂的低角度旋转阴影均是如此。为了创建高质量和低谷物金属层，电子束枪和蒸发室必须保持极度清洁。

与上一代MED蒸发器相比，新一代EM ACE电子束包衣器有几处改进。包衣机新组件的稳健性使其有所不同。电子束枪的设计和最新的电子器件有可能在触摸屏显示器上获得所有参数的数字视图，这是一个很大的优势。此外，安全反馈的存在，如果张力和电流参数超过一定值，不允许蒸发，将有助于保存机器并在更安全的条件下工作。

这里描述的具体应用意味着使用非常精确和可重现的阴影角度，应突出显示通过触摸屏以数字方式控制的复杂电动载物台的存在。最后但同样重要的是，单次运行和设计过程的所有参数都可以存储、检索并放入具有非常直观接口的序列中，这也允许没有经验的用户与机器一起工作。