使用旋转设备进行光片样本安装

在图像采集过程中，标本准备有两个主要要求。首先，标本需要放置在检测物镜的焦平面内，并位于两个镜子之间。其次，标本需要略微抬高，以便镜子或光片能够到达标本的远端。

为了方便地在样本空间的自由区域中定位标本，可以使用 FEP（氟化乙烯丙烯）管。FEP 的折射率为 1.338，非常适合用于成像浸没在水溶液中的标本，尤其是在使用中等数值孔径（NA）的物镜时。

在 SP8 DLS 成像中，样本可以使用 FEP 管定位并固定。

这种标本安装方法的优点包括：

• 处理方便和
• 可以使用低浓度的支架介质（如琼脂糖或甲基纤维素），在生理条件下提供足够的样本稳定性，适合长期体内成像。

然而，这种方法的缺点是标本的对齐难度较大，尤其是在需要将感兴趣区域暴露于用于荧光检测的侧面时。

为了克服这一缺点，同时保持上述优点，设计了一种旋转装置，允许轻松调整 FEP 管的角度，以便样本能够最佳对齐进行成像。这种设置在其他研究中已得到验证 [1, 2, 3]。

用于 DLS 成像的样本旋转装置（编号 158007064）包括：

• DLS旋转装置；
• 显微镜玻璃盖玻片（21 x 26 毫米）；以及
• FEP 管（Camitec，外径 2.00 毫米，内径 1.80 毫米）。

然而，旋转装置中不包括用于密封盖玻片的硅胶或其他材料。

第一步：清洁 FEP 管（推荐程序）

如 Kaufmann 等 [4]报告中所述，FEP 管在使用前应按以下方式处理：

• 首先，所有溶液必须去气并用注射器过滤（Millex-HV，PVDF，0.45 µm）；
• 用 1 M NaOH（Merck）冲洗；
• 将其放入 0.5 M NaOH 中超声处理 10 分钟；
• 用双蒸水和 70%乙醇冲洗
• 在 70%乙醇中超声处理 10 分钟；
• 用双蒸水冲洗；并且
• 最后，存放在双蒸水中。

第 2 步：用玻璃盖子密封旋转装置

将盖玻片密封到旋转装置上的方法如下：

• 在旋转装置底部凹槽的内缘涂抹硅胶（见下方 A）；
• 添加盖玻璃并轻轻按压玻璃，以确保其均匀贴合，以便在所有点上形成良好的密封（见下方 B）；并且
• 检查腔体密封，向旋转装置中添加一些蒸馏水，看看是否出现泄漏（见下文 C）。

第 3 步：将标本放入 FEP 管中

标本放置在固定介质中，并用移液管或注射器抽入管中（如下所示）。

FEP 管的长度需要为 38 毫米。

第 4 步：将 FEP 管插入旋转装置中

在 FEP 管的两侧安装黑色盖子（见下方的 A 和 B）。

如下所示，将 FEP 管的带有黑色盖子和磁铁的端部插入旋转装置的销钉（1）中。

最后，管的另一侧固定在位置上（见下图中的 1）。

步骤 3：开始图像采集

将玻璃底部的培养皿放在TCS SP8 DLS扫描台上（见下文）。

注意： 该旋转装置仅与以下 z-Galvo 载物台样品夹兼容：

• 158004118 可旋转样品夹反向和
• 158004119 通用样品夹。

请注意：该旋转装置仅与特定的 z-Galvo 载物台样品夹兼容。初始化后再将旋转装置放置到 z-Galvo 载物台上，并在更换物镜时注意防止旋转装置轮子与物镜意外接触。

使用包含在 LAS X 软件中的 LightSheet Wizard，您现在可以获取样本的 3D 图像。

图 12：从不同侧面观察的果蝇胚胎。感谢 Pavel Tomancak，MPI-CBG，德累斯顿，德国。