自适应反卷积与 Computational Clearing 结合的力量

自 1595 年发明显微镜 [1]、19 世纪 50 年代发现荧光和首次描述光学显微镜观察染色样品[1]以来，宽场（WF）荧光显微镜已成为一种广泛使用的成像技术，使工程和科学学科受益匪浅。我们对科学的好奇不断推动着显微镜的发展，其目标是观察和解析更多的结构细节。然而，由于光的波动性和光学元件对光的衍射，图像分辨率受到被称为衍射极限的限制。在 宽场荧光显微镜中，拍摄图像的对比度和分辨率会因多种原因而降低，其中包括：从相邻平面收集的光线、散射光和相机传感器噪声，所有这些都会增加图像的朦胧/模糊（背景噪声）。图像分辨率和对比度的其他损失可能与系统的光学响应函数，或通常称为点扩散函数（PSF）有关。PSF 描述了理想化的点光源在探测器平面成像时的样子，它就像一个低通滤波器，滤除了图像中的高频信息（图 1）。
在数学上，图像形成 (i) 可以表示为观测物体 (o) 与添加了噪声（泊松和/或高斯 - ε）的 PSF (h) 之间的卷积 (*)，如公式1

为了尽量减少 PSF 降低图像对比度和分辨率的影响，通常会使用反卷积等图像复原技术来恢复和增强图像中丢失的细节。

反卷积是一种用于恢复被 PSF 和噪声破坏的物体图像的计算方法。给定获取的图像 i、观测对象 o 和 PSF 信息（可通过理论或实验确定），可以通过反卷积过程还原公式 1中的观测对象。要进行反卷积，需要通过傅立叶变换将物体和 PSF 变换到频域，如公式 2 所示：

由于计算上的原因，反卷积在频域中进行，公式 1 可改写为公式 3 所示，并求解 O：

其中，F、F-1、O、H 和 £ 分别为傅里叶变换、反傅里叶变换、傅里叶变换观测对象、傅里叶变换 PSF（称为光传递函数；OTF）和傅里叶变换噪声。然而，当 H 接近零时（在 PSF 边缘），公式 3 中的最左项和噪声项都会变得越来越大，从而放大噪声并产生伪影。为了限制放大的噪声量，可以通过截断 PSF的方法，但这会导致图像细节丢失。

为解决上述图像复原问题，人们提出了多种反卷积算法 [2-8]。例如，基于贝叶斯迭代法的理查森-露西（RL）算法是利用泊松或高斯噪声处理方式描述的图像统计来制定的。对概率的负对数进行最小化 [2,3]，泊松和高斯噪声处理的反卷积 RL 方程为公式 4：

泊松噪声处理 [2,3] 和

高斯噪声处理 [10] 。公式 4 中的 i 和 o 已在之前定义，h+ 是翻转的 PSF。然而，与公式 3 类似，RL 反卷积方法容易受到放大噪声的影响，导致反卷积被噪声所主导 [2,3]，如图 2 所示。限制放大图像噪声的部分处理方法是提前终止收敛，或仔细选择一个 ok 值，并用低通滤波器（如高斯滤波器）对其进行预模糊处理 [2,3]。最近，人们提出了一些新的反卷积方法，这些方法使用正则化项，可以添加到算法中，对反卷积进行约束。这类正则化技术包括 Tikhonov-Miller、 Total-Variation和 Good 氏粗糙度等方法 [2,4-9]。这些正则化项的目的是对反卷积进行惩罚，以限制图像噪声和伪影的产生，从而达到保留图像细节的目的。

徕卡显微系统使用的方法是一种加速自适应的 RL 方法，该方法使用 Good 氏粗糙度进行正则化和约束 [11]。利用贝叶斯统计方法和高斯噪声处理，反卷积时需要最小化的函数是：

其中，γ 是正则化项，∇ 是微分算子，h 是吉布森-兰尼 PSF。在公式 5 中，正则化项 γ 取决于局部信噪比（SNR），是在整个图像上创建的自适应信噪比（x，y）系数的函数，如图 3 所示。同时，γ∫1[∇o]2 对反卷积起惩罚作用，正则化项与 SNR (x, y) 的非线性关系为：

SNRmax 是预先确定的最大信噪比值，γmax 是预先确定的最大正则化值。结果就是公式 5 中的自适应正则化，与信噪比较高的区域相比，信噪比较低的区域的反卷积会受到更大的惩罚。这样，整个图像的反卷积过程都得到了适当的正则化，避免了图像伪影和噪声放大。

使用徕卡显微系统提供的反卷积算法，用户可以定义反卷积的迭代次数，或使用默认选项让算法决定收敛的停止标准。后一种选项更省时，而且用户无需猜测反卷积的效果。与徕卡显微系统的 Instant Computational Clearing (ICC) 算法类似，所述自适应反卷积方法包含在所有THUNDER成像系统中，并完全集成到成像工作流程 [12]。

宽场荧光图像的反卷积效果取决于多个因素，包括从相邻平面收集的光量、样品厚度、散射光的程度以及图像的信噪比。例如，在厚度较大的样本中，样本内部可能会发生明显的光散射，导致反卷积无法生成具有更高分辨率和对比度的复原图像。对于信噪比较高、背景噪声极小的样本，反卷积可能会产生过度处理的图像，导致图像特征之间出现不必要的尖锐边界转换。因此，成像工作流程必须能够适应不同厚度、不同信噪比的样品。

在之前的技术简介中，我们讨论了 徕卡显微系统的 ICC 算法，这是一种通过去除背景噪声来恢复图像对比度的方法。该算法通过最小化非二次成本函数来估计和减去图像中的背景噪声，从而提高对比度 [12]。为了解决前面提到的反卷积缺陷，徕卡公司推出了一种结合两种计算算法的工作流程，允许用户执行 ICC 或 ICC 与反卷积。对于后者，可根据样本厚度和信噪比在两种不同的处理模式之间选择配对，分别称为小体积和大体积 Computational Clearing（SVCC 和 LVCC）。

使用 SVCC 时，自适应反卷积在THUNDER ICC 之前进行。在 SVCC 中，理论的 PSF 被用于了解系统光学参数（显微镜物镜类型、发射波长、样品包埋介质等）的反卷积。选择使用 SVCC 对 "噪声 "图像尤为重要，图 4，因为在通过 ICC 自动去除不需要的背景之前，自适应反卷积将提高信噪比，如图 4C。在 LVCC 中，ICC 在反卷积之前进行，并使用受 ICC 参数影响的 PSF。LVCC 非常适合信噪比较高、背景噪声较多的样本，这在厚样本中很常见，图 5。通过在反卷积之前执行 ICC，空间特征的对比度得到增强（图 5C），从而可以通过反卷积对剩余信号进行更精确的处理。

对于 SVCC 和 LVCC，ICC 的强度是用户可调的。强度参数 (s) 可调节从图像 (I) 中减去估算的背景强度 (I-background) 大小，从而得到最终图像 (I')：

通过强度参数，SVCC 和 LVCC使用户可以根据样本特点对计算算法进行微调，从而对数据进行最佳处理。与 ICC 一样，SVCC 和 LVCC 都可以应用在图像采集过程中或采集之后，并始终保留原始数据。这意味着用户可以直接将原始数据与处理后的数据进行比较，以便进一步量化。量化主题将在下一期技术简报中讨论。

我们衷心感谢 Kai Walter（软件工程师）、Louise Bertrand（Widefield 产品性能经理）和 Jan Schumacher（高级工作流程专家）阅读本技术简介并提出意见。