超分辨率 GSDIM 显微镜

在传统荧光显微镜中，荧光染料中的非定域π电子从基态S0跃迁到激发态S1。当它们振荡回基态S0时，会发出荧光。GSDIM技术通过使大部分荧光染料进入暗态（图1），降低了参与这一振荡周期的电子数量（Fölling等人，2008；Bierwagen等人，2010；Testa等人，2010）。这就减少了可激发的荧光团数量，直到能够检测到单个分子。随后，单个分子自发地从暗态返回到可激发的基态并发光，而其他分子则通过切换到暗态再次失活。因此，荧光团分子在样本中发光或“闪烁”。单个荧光团的确切位置可以通过算法确定。所有荧光团的位置信息都收集在数千张独立图像中，这些图像的坐标用于计算超分辨率GSDIM图像。因此，GSDIM图像中显示的结构以类似于点描式绘画风格的方式产生。

图1：基于简化Jablonski图的GSDIM方法示意图。荧光团中的非定域π电子可以处于基态S0、激发态S1（这两种状态都被称为“开”态）或三重态或自由基暗态（这两种都是“关”态）。当发出荧光时，电子在基态和激发态之间循环。与这些“开”态不同，“关”态的荧光团无法发光。这些“关”态通常寿命较长，但很难达到，因为需要发生系统间窜越。通过在嵌入介质中设置适当的环境条件，并巧妙地选择用于免疫荧光的标准荧光团，就有可能通过极端光强激发荧光团，使其可逆地关闭。当足够多的分子处于“关”态时，就有可能检测到样品中的单个分子。

初级纤毛是人体极化上皮细胞顶端表面上的基于微管的细胞结构。例如，在肾脏、胆管和胰管的管状上皮细胞上就有这种形式的单纤毛。在这里，它们作为机械传感器发挥着关键作用——例如，它们决定流体的组成或其流速（Fliegauf等人，2007）。与此同时，它们还参与维持细胞极性，这一点已在Madin Darby犬肾（MDCK）细胞中得到证实（Bacallao等人，1989）。初级纤毛在细胞周期的间期形成，起源于一个与质膜相关、宽约250纳米的结构，称为基体，即轴丝是在此结构的基础上形成的（Singla等人，2006）。基体的基本框架由九个微管二聚体（9+0）组成。这里分布着各种中心蛋白，它们被认为是基底体的重要组成部分。这些蛋白质属于钙调蛋白家族，具有EF手性基序，能够结合Ca²⁺（Salisbury，2007）。Ca²⁺结合引起的构象变化调节中心蛋白与其他蛋白质（如微管蛋白或半乳糖凝集素-3）的相互作用。在鼠类和人类生物体中，存在四种不同类型的中心蛋白。中心蛋白-2和-3普遍表达，并聚集在中心体和中心体周围区域或细胞的基体中。另一方面，中心蛋白-1仅存在于生殖细胞和视网膜中，而中心蛋白-4则仅存在于完全分化的细胞中（Salisbury，2007）。

纤毛生成障碍或纤毛功能紊乱是视网膜变性、多囊肾病、脑积水或BBS（Bardet-Biedl综合征）等多种疾病的病因。

Leica SR GSD（Leica Microsystems，Wetzlar）是一款新型多用途显微镜，不仅可用于分辨率低至20纳米的超分辨率GSDIM成像，还可以用于全内反射荧光（TIRF）显微镜和高速宽场活细胞成像。这为研究顶膜结构及其蛋白质组成提供了新颖且极其详细的见解。通过使用免疫组织化学方法，使用双染色法将中心蛋白-2与微管蛋白结合，并通过GSDIM技术进行成像（图2A）。顶膜下的微管网络清晰可见。其他可见特征是每个细胞出现一次的半圆形至圆形中心结构。这些结构围绕基体排列，也被中心蛋白-2染色。在此之前，我们也观察到了中心蛋白-2的类似分布模式。图2B显示了中心蛋白-2与其结合伴侣半乳糖凝集素-3的双染色（Koch等人，2010）。然而，与传统产生的图像相比，超分辨率GSDIM图像提供了更为清晰的蛋白质分布视图。

GSDIM技术在光学显微镜成像方面取得了进一步突破，能够观察到衍射极限以下的细胞结构。在样品制备方面，可以使用大多数实验室已经建立的用于衍射极限宽场和共聚焦显微镜的免疫组织化学方法。GSD显微镜可以揭示迄今为止不可见的结构。通过对蛋白质和其相互作用伙伴进行高度详细的成像，可以更深入地了解细胞内的基本过程。未来，这项技术将有助于获得关于以前无法治愈疾病的细胞原因的新信息。