比例成像

研究活动越来越关注于识别和空间、时间分布，例如局部“热点”，以动态变化的离子浓度、电压或 pH 值在细胞或细胞网络中。这些“热点”通常局限于细胞的特定部分或细胞网络中的某些细胞。此外，这些区域在细胞代谢或结构方面通常与样本的其余部分具有不同的特性。用于研究动态生理状态的传统荧光染料在离子结合、pH 变化或电压变化时会改变其发射强度（例如，fluo-4 在钙结合时发射增强）。然而，这些标记并未考虑到结构、直径或标记摄取/表达的差异可能导致发射光量的变化，而这些变化与实际的离子浓度、电压或 pH 值并不相关。为了定量和可比地检测细胞结构或不同细胞的变化，需要一种对结构直径和荧光染料浓度不敏感的方法。 与非比率成像方法相比，比率成像提供了一个机会，可以相对细胞直径、荧光染料浓度和成像设备的光学特性，重复测量绝对细胞内离子、电压和 pH 水平/变化。然而，比率成像依赖于激发波长或检测波长的快速变化、强光源、光学组件的优良传输和快速信号检测。最近开发的超快速滤光轮、UV光优化物镜、高灵敏度荧光染料和新型CCD相机，使得高空间分辨率下的高速度活细胞成像变得经济实惠。

如上所述，在比率成像中，成像的是发射位移而不仅仅是强度变化。为了测量发射位移，必须通过使用两种不同的激发波长或在两个不同的发射波长下检测来测量荧光染料或荧光染料组合的强度变化。在常用的钙成像染料 fura-2 的情况下，该染料需要用 340 nm 和 380 nm 波长的光激发，检测波长为 510 nm。相比之下，钙成像染料 indo-1 通常用 350 nm 波长的光激发，检测波长为 405 nm 和 485 nm。

但为什么需要双重激发或发射检测？为什么不简单地测量荧光团强度的变化？

在一个实验中，荧光染料用于检测离子水平、电压或 pH 的变化，发射的荧光光强依赖于几个属性。这些在下面的方程中描述：

该方程表明，光强度在很大程度上依赖于光路中荧光团的数量。光路中荧光团的数量取决于细胞中荧光团的实际浓度（c）（由标记物的摄取或表达决定）和被成像样本的直径（d）。这使得仅通过观察荧光强度来直接估计所研究离子的浓度、pH 水平或电压变化变得困难，例如，不能简单地说：“强度为 100 等于细胞中 100 nM 的游离钙”。样本直径（d）、荧光团浓度（c）以及样本和设置的光学特性（K）都很难测量，但对检测到的整体强度有显著影响。此外，还必须记住，上述公式对于样本中的任何给定点都是成立的。由于样本的直径（d）和荧光团浓度（c）在一个样本甚至在单个细胞内并不均匀，因此在获取的样本图像中的每个像素的 c 和 d 值可能不同。 在样本的“A”点，细胞的直径相对较大，而游离钙则相对较低，光强度可能与“B”点相同，但情况正好相反。然而，实验者可能错误地得出结论，认为两处的钙浓度相似，因为检测到的荧光光强度相似。

为了克服这些问题并精确测量绝对离子浓度、pH 水平或电压，已经开发了比率成像。所有比率方法的共同点是测量发射光的强度两次，并计算这些强度的比率（R）。根据所使用的荧光染料或荧光染料组合，荧光染料要么用两种不同波长的光激发，并在一个波长下测量发射强度——要么用一种波长的光激发荧光染料或荧光染料组合，并在两个不同波长下测量发射。这简单意味着获取了两幅灰度图像，并从中计算出比率图像。这两幅灰度图像通常在强度上有所不同，但图像中每个像素的强度可以用下面的公式描述：

在实践中，比例是由计算机计算的，在许多情况下是在时间延迟实验期间在线计算的。通过计算两个独立获取的灰度图像对应像素的灰度值比例，生成比例图像。请记住，灰度图像基本上是一个灰度值矩阵，其大小为相机分辨率或感兴趣区域（ROI）（通常为 512x512，最多可达 1000x1000 像素以上）。在使用染料 Fura-2（激发：340 nm 和 380 nm，发射：510 nm）的钙成像时间延迟实验中，这将如下进行（假设图像大小为 3 x 3 像素）：

此操作针对时间推移实验中每对图像的每个像素执行，创建一个比率图像堆栈。最后，可以将伪彩色图应用于比率图像堆栈，然后可以像正常的灰度时间推移电影一样观看和量化该堆栈。

除了上述提到的优点，计算比率还有一个额外的好处。在使用离子、电压或 pH 敏感荧光探针进行活细胞成像时，通常会在相应波长下观察到荧光强度的微小变化。然而，在比率成像中，通常观察到一个波长的强度增加和另一个波长的强度减少（无论探针是用两个波长激发还是检测）。如果随后计算两个获取图像的比率，基线与信号幅度之间的差异将比荧光探针的单纯强度变化更为明显。因此，比率成像放大了检测信号的幅度。这对于FRET实验特别重要，因为在能量转移过程中，受体蛋白的荧光强度下降，而供体蛋白的荧光强度增加。