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利用多孔板中的细胞培养支撑物对干细胞进行动态研究

通过3D显微成像技术，在不移除的情况下，可以快速检查在多孔板中生长的诱导多能干细胞（iPSCs）

[Translate to chinese:] THUNDER image of brain-capillary endothelial-like cells derived from human iPSCs (induced pluripotent stem cells) where cyan indicates nuclei and magenta tight junctions. Brain-capillary_endothelial-like_cells_derived_from_human_iPSCs.jpg

本文展示了如何使用THUNDER成像仪高效地对设置在多孔板中的细胞支撑物上的活细胞进行成像，以检查细胞生长情况。成像的对象是从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中获得的类脑毛细血管内皮细胞。设置和取出支撑物所需的时间减少了约3倍，从而减轻了工作负担并简化了工作流程。高性能的物镜能够实现高分辨率和长工作距离，从而进行高分辨率成像和超高速图像采集。

为什么要使用细胞培养插板？

细胞培养插板，也称为细胞培养支撑物，用于更好地模拟体内细胞所处的三维环境[1,2]。与培养皿、烧瓶或多孔板的平面表面不同，细胞培养插板中的顶（上）面和基侧（底面）细胞表面都暴露于培养环境中。这些插板被放入多孔板中，市面上有各种类型的膜、涂层、定制表面以及孔径和密度可供选择。细胞培养插板还用于研究细胞转运、分泌、扩散、迁移和组织工程。

在这里，目标是使用细胞培养插板，利用人类诱导多能干细胞（iPSCs）生成类似脑毛细血管内皮细胞[3,4]。这些类似脑细胞的内皮细胞与星形胶质细胞、周细胞和神经元一起构成血脑屏障（BBB）。构建高质量和准确的血脑屏障体外评估系统对于筛选治疗神经退行性疾病和与血脑屏障相关的疾病的药物具有重要意义。

在细胞培养插板中检查细胞的传统方法

直到最近，如果用户需要在实验过程中评估设置在多孔板中的细胞培养插板中的细胞，基本上有两种方法。他们可以使用专用电极来检查培养细胞的电阻，或者移除覆盖插板的膜，取出插板，然后使用显微镜在玻片上观察（请参考图1）。

图1：使用以下方法在细胞培养插板和多孔板中评估细胞：A）使用电极检查电阻；B）将插板放置在玻片上，并使用倒置复合显微镜进行观察。
图1：使用以下方法在细胞培养插板和多孔板中评估细胞：A）使用电极检查电阻；B）将插板放置在玻片上，并使用倒置复合显微镜进行观察。

新的快速可靠方式检查细胞培养插板中的细胞

现在，使用THUNDER成像仪可以通过3D显微成像有效地检查设置在多孔板中的细胞培养插板中的细胞（请参考图2）。

图2：使用THUNDER Imager 3D Assay评估细胞培养插板和多孔板中的细胞。
图2：使用THUNDER Imager 3D Assay评估细胞培养插板和多孔板中的细胞。

THUNDER成像仪利用了高性能的物镜，可以实现高分辨率并具有长工作距离。Leica物镜的放大倍数为16倍，数值孔径（NA）为0.6，工作距离为2.5毫米（请参考图3），可以与THUNDER成像仪一起使用，以观察仍设置在多孔板中的细胞培养插板中的活细胞。

图3：用于观察设置在多孔板中的细胞培养插板中活细胞的Leica物镜：16倍放大倍数，0.6 NA，2.5毫米工作距离。
图3：用于观察设置在多孔板中的细胞培养插板中活细胞的Leica物镜：16倍放大倍数，0.6 NA，2.5毫米工作距离。

使用插板的活细胞THUNDER成像

本研究使用了从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中获得的类似脑毛细血管内皮细胞。将iPSC衍生的内皮样细胞用DAPI染色以标记细胞核（青色）并用Alexa Fluor 488染色以标记紧密连接（品红色） [5]，然后培养在设置在12孔板中的插板中（来自Corning的插板和孔板） [3,4]。有关细胞培养和制备的更多详细信息，读者可以参考参考文献3和4。

使用THUNDER成像仪获取设置在多孔板中的细胞培养插板中活内皮样细胞的超高速和高分辨率图像：

  • 快速Z轴成像，在大约20秒内获取垂直（Z）方向上的70个焦平面，同时使用快速通道切换在两个波长之间交替（参考图4）；
  • 通过计算清除法（Computational Clearing）[6,7]去除活细胞样本原始图像中的散射光（参考图5）。
图4：使用THUNDER Imager Live Cell通过两种不同波长对细胞培养插板中的活细胞进行快速Z轴荧光成像的示意图。
图4：使用THUNDER Imager Live Cell通过两种不同波长对细胞培养插板中的活细胞进行快速Z轴荧光成像的示意图。

与使用传统的宽场显微镜相比，当使用THUNDER Imager Live Cell或3D Assay时，细胞培养插板中生长的iPSC的检查速度大约提高了3倍，因为无需将插板从多孔板中取出进行显微镜成像。

图5：细胞培养插板中活iPSC衍生的内皮样细胞的原始宽场显微镜图像和THUNDER图像的对比。对于THUNDER成像，与常规宽场显微镜不同，插板无需从多孔板中取出。THUNDER图像经过计算清除法处理。
图5：细胞培养插板中活iPSC衍生的内皮样细胞的原始宽场显微镜图像和THUNDER图像的对比。对于THUNDER成像，与常规宽场显微镜不同，插板无需从多孔板中取出。THUNDER图像经过计算清除法处理。

结论

结果表明，使用THUNDER成像仪可以快速可靠地检查设置在多孔板中的细胞培养插板中的活细胞。成像的细胞是从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中获得的类似脑毛细血管内皮细胞。工作流程变得更简单，检查细胞所需的时间减少了大约3倍。这种好处来自于使用THUNDER成像检查细胞时，无需将插板从多孔板中取出然后再放回。

参考文献

  1. A. Kurmashev, J.A. Boos, B.-J. Laventie, A.L. Swart, R. Sütterlin, T. Junne, U. Jenal, A. Hierlemann, Transwell-based microphysiological platform for high-resolution imaging of airway tissues, bioRxiv preprint (2023) DOI: 10.1101/2023.11.22.567838.
  2. J. Marshall, Transwell Invasion Assays, chap. in Cell Migration: Developmental Methods and Protocols, Eds. C. Wells, M. Parsons, Methods in Molecular Biology, vol. 769 (Humana Press, 2011), DOI: 10.1007/978-1-61779-207-6_8.
  3. H. Aoki, M. Yamashita, T. Hashita, T. Iwao, M. Aoyama,T. Matsunaga, Generation of Brain Microvascular Endothelial-like Cells from Human iPS Cell-Derived Endothelial Progenitor Cells Using TGF-β Receptor Inhibitor, Laminin 511 Fragment, and Neuronal Cell Culture Supplements, Pharmaceutics (2022) vol. 14, iss. 12, 2697, DOI: 10.3390/pharmaceutics14122697.
  4. M. Yamashita, H. Aoki, T. Hashita, T. Iwao, T. Matsunaga, Inhibition of transforming growth factor beta signaling pathway promotes differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial-like cells, Fluids and Barriers of the CNS (2020) vol. 17, art. num. 36, DOI: 10.1186/s12987-020-00197-1.
  5. C. Greb, Fluorescent Dyes: An Overview, Science Lab (2022) Leica Microsystems. 
  6. J. Schumacher, L. Bertrand, Real Time Images of 3D Specimens with Sharp Contrast Free of Haze: Technology Note THUNDER Imagers: How do they really work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
  7. L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems. 

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