共聚焦显微镜的主分光装置

显微镜技术的分类之一是依据光线被施加到显微样本的方向。如果样本位于光源和观察者之间，即样本被“照射”，则我们称之为“透射光显微镜”。另一种方式是将照明设置在观察样本的同一侧，这称为“入射光显微镜”。实际上，我们日常生活中的观察主要是入射光：周围的世界被阳光或人造光源照亮，我们随后感知到由物体反射或散射的光。透射光可能在特殊情况下出现，例如观察窗玻璃上的死苍蝇。

当您直接看向光源时，如蜡烛、夜空中的星星、萤火虫或电视屏幕（避免直视太阳），此时我们观察到的是“自发光物体”。这些物体不需要外部照明，因此“入射光”和“透射光”的术语在此不适用。

入射光显微镜已成为生物医学研究及其他领域的重要技术，尤其是作为荧光显微镜的一种形式。光被吸收，从而激发了通常通过人工方法引入样本中的荧光分子。经过一段时间的延迟，这些分子释放出能量，但其波长（斯托克斯位移）比入射光长。

如果我们在从我们检测发射信号的同一侧照射样本，我们必须某种方式分离激发光和发射光。这需要使用光束分割器。

入射照明（也称Epi-illumination）可以通过以一定角度对显微镜光轴施加光线来实现。这种照明方式早在1665年就已被Robert Hooke描述。这种方法在入射和透射照明之间的极端变体是光片显微镜（ultramicroscopy），其照明方向垂直于光轴。光轴同轴照明的优势在于可以使用同一高性能物镜透镜进行照明和检测。在这种情况下，我们必须在物镜后某处分离照明和检测。最简单的方法是在光路中插入一个半透明镜。

对于反射光，灰色镜是理想的解决方案。灰色镜同时反射和透射所有颜色的相等量，因此它也被称为50/50光束分割器。在荧光显微中，这样的设计将导致损失一半珍贵的荧光发射。一个变通的方法是使用非对称的灰色分光器，比如80/20或95/5分光器。这样，大部分的发射光得以保存，但会浪费更多的激发光。这一困境通过使用二色色分光器得到解决。它们展示了根据设计而定的高反射率和高透明度的交替光谱带。

二色镜通过在玻璃表面沉积多层薄的介质材料制成。其设计和制造过程复杂。尽管如此，市面上有许多非常不同的光束分割器可供选择。这些分割镜可用于单一类型的荧光或多种激发和发射（如图3所示）。在所有情况下，镜子必须在特定波长带内反射激发光，并在互补的带宽内透射发射光。发射效率由发射带的整体透明度和激发带的狭窄度定义。在多带分光镜的情况下，当激发带与荧光信号的发射带重叠时，效率会降低。

当前二色光束分割器在发射光谱区的透射效率通常介于90%至98%之间，这已足够接近最大透射率。然而，反射带宽范围通常在25纳米或更低。如果激发线紧邻透射开始的边缘，对于单一用途的分光镜而言，这样的带宽可以忽略。但是，在多数情况下，需要多个激发带，因此25纳米的带宽会导致发射信号的损失（取决于荧光团的发射特性）。

二色光束分割镜的显著特点是滤光玻璃的光谱参数不可修改。若需改变激发和发射特性，就必须在光路中更换不同的分割镜。通常，一个滑块或转盘装有多种不同的分光器，但很少超过5片。这种方法的两个后果是：首先，激发波长的组合可能受限。即使设备配备了8条激光线，也可能有255种不同的组合。为了获得最大性能，需要一个装有255种不同分光器的滤光轮或滑块—这并不是一个实用的解决方案。因此，在许多情况下，必须使用多波段分光器，这可能会在光谱的红色部分丢失一些发射信号（参见图3中的蓝色曲线）。第二个难题是这些滤光片的更换速度。例如，在需要连续记录两组激发的情况下或用于激发比率染料的实验中，快速更换照明模式至关重要。标准装置的切换时间大约为1秒。特殊设计的装置可能达到0.1秒或更快。

通过声光晶体进行的可调波束分割是一个全新的分离入射光系统中激发和发射信号的方法（见图2“AOBS”）。这些设备的工作原理是基于这样一个事实：施加到适当晶体上的声波会使选择的颜色与剩余光谱相比在不同角度离开晶体。通过调节施加的声波的频率和幅度，可以控制哪些颜色被偏转以及偏转的程度。此外，可以施加一系列声波，从而偏转几乎可以自由选择的一组颜色。这种晶体在共焦显微镜中的首次应用导致了在激发路径中替换了大型选择滤光片阵列。

第二种实现方式是替代原始分光镜的库存。这里，声光晶体以反向模式使用。声光设备强烈依赖于偏振，这对于激光激发来说不是问题，因为激光光本身就是偏振的。为了解决发射信号的偏振分裂问题，必须采取适当的措施。我们将简要介绍这种设备的设计。

激光光通过一个小镜子沿着显微镜的光轴耦合进入第一个晶体，并从此晶体沿着光轴出射，用以激发样品（见图4）：

激光通过显微镜的光轴耦合，通过一个小镜子进行。由于激光光是偏振的，元件安排方式使得这种偏振方向可以激发样品。任何其他的偏振方向将会在不同的角度从晶体中出射。然而，激光光只含有一个偏振方向。通过重新编程，线路可以在几微秒内切换。由于编程频率可以自由调整，激发颜色也可以调整。如果需要多于一个的激发颜色，则所有激光线以相同方式在光路中同时同轴地进入（不需要多路复用）。再次，激发模式可以在微秒级内切换。

荧光发射通常不是偏振的。两个方向在第一个晶体中被分裂，并需要合并（见图5）。

两个偏振方向在第二个晶体中合并，并沿着显微镜的光轴从该晶体出射。然后通过小孔对光进行空间过滤，生成光学切片——就像在任何其他真正的共焦显微镜中一样。最终，光被分离成光谱通道，进行探测，并记录图像。

声光分波器（AOBS）通过两个声光晶体，发射光必须通过这些晶体。尽管如此，如图3（红色曲线）所示，平均透射率为95%。图3中显示的测量结果清晰地显示了AOBS在可调谐激发带外约95%的透射率，即在透射带中。

事实上，不同的颜色不会在第二个晶体的同一位置出射。光线是平行的，但不是同轴的。这个结果会影响光学切片吗？由于光线是平行的，它们被聚焦到中间图像的同一个点上，即小孔所在的位置。使用AOBS系统的光学切片性能与使用其他分离激发和发射光的方式的系统相同。另一个问题是，颜色色散是否会影响光谱性能？的确如此，但我们可以利用这一点：Leica Microsystems的SP探测器通过棱镜实现光谱分离。光谱“预分散”的光束通过SP探测器进行优雅处理，只获得进一步的有益特性。

声光分波器提供了一系列有益特性：

1. 由于是单一的固定装置，永远不会有各种元件调整不当的问题。
2. 通过电子控制生成的波，可以在10微秒内快速切换线路。
3. 由于晶体具有高性能的防反射涂层，该装置的整体透射率平均超过95%。
4. 一个装置适用于任何激光线，因为带宽颜色可以调节到任何可见光波长。
5. 由于带宽颜色可以自由调节，AOBS是唯一使白光激光源与共焦显微镜实现实际耦合的装置。
6. 以编程整套带宽，使AOBS可以作为多带分裂器，同时操作多达8种颜色。与白光源结合时，激发组合的可能数量达到了“无穷大”。
7. 用户只需选择所需的激发颜色，共焦系统将安排适当的滤波和分裂。不需要为AOBS（主光束分裂）和声光可调滤光器（AOTF；线路选择）单独控制，因为两者都由相同的装置操作。

1. Birk H. et al: „Programmable beam-splitter for confocal laser scanning microscopy.” In: “Three-Dimensional and Multidimensional Microscopy: Image Acquisition and Processing IX” Eds Conchello JA, Cogswell CJ & Wilson T, Proceedings of SPIE Vol. 4621 (2002)
2. Rietdorf J and Stelzer EKH: “Special optical elements” In: “Handbook of Biological Confocal Microscopy” Ed Pawley J. 3rd edition; Springer Heidelberg & New York. Chapter 3, pp 43-58 (2013)
3. Birk H: „Optische Anordnung und Scanmikroskop“. Patentschrift DE 101 37 155 (2002)
4. Borlinghaus RT: The White Confocal – Microscopic Optical Sectioning in all Colors. Springer International, Heidelberg (2017) ISBN 978-3-319-55561-4 (in press).