Blood vessel system of a zebrafish larvae.

克服显微镜成像移动斑马鱼幼虫时的挑战

在非固定的斑马鱼幼虫中捕捉三维信息或快速事件,如心跳,使用Mica

Blood vessel system of a zebrafish larvae Bloodvesselsystem_of_a_zebrafish_larvae.jpg

斑马鱼是一种有价值的模型生物,具有许多有益的特性。然而,成像整个生物体面临挑战,因为它并不是静止的。在这里,这个案例研究展示了如何在斑马鱼幼虫的静止期间进行成像,并在移动后轻松重新定位。Mica 的无缝集成的宽场和共聚焦能力被利用来捕捉快速事件,如心跳,几乎没有标准宽场系统固有的失焦背景噪声。

鱼类研究中的成像挑战

尽管斑马鱼有许多优点,但在成像方面仍然存在一些挑战,特别是对于活体标本:

  1. 胚胎的大小:

    斑马鱼胚胎可以生长到几百微米,这在使用现代标准显微镜时可能会很具挑战性,尤其是在需要高分辨率时。

  2. 活胚胎的运动:

    活胚胎是自然移动的,这使得图像捕捉变得复杂。保持胚胎静止以进行成像而不限制其发育或行为仍然是一个挑战。

通过Mica克服成像障碍

Mica 通过在运动等挑战性条件下实现高质量成像来解决这些挑战。本案例研究展示了 Mica 如何通过成像自由移动的斑马鱼幼虫的血流来克服一些障碍。血流通过两种荧光标记可视化:DsRed 用于红细胞,eGFP 用于血管。

寻找非固定幼虫

传统上,为了避免繁琐的重新定位过程,幼虫会被固定。Mica 的“样本查找器”功能通过生成微小努力下的孔板概览来简化这一过程。对于更高倍数成像,导航就像在概览上点击位置或在 Mica 的完全集成导航工具中进行其他采集一样简单。如果幼虫移动,低倍数(1.6 倍)的螺旋扫描可以快速定位它,从而允许切换回更高倍数(10 到 63 倍)进行详细成像。

动态事件的延时成像

Mica 支持多种成像模式,包括透射光和高对比度集成调制对比(IMC;兼容塑料底载体,视频 1)成像以及宽场和共聚焦模式下的荧光成像。这种多样性使研究人员能够选择最适合其实验的成像模式。

使用水浸物镜进行长期高倍成像(在工作距离的限制内)进一步得到了反馈驱动的自适应浸没的支持,以确保持续浸没。

视频 1: 使用集成调制对比(IMC)对斑马鱼幼虫中红细胞运动进行的延时成像。仅 IMC 就提供了足够的对比度来可视化动态事件,例如红细胞在血管中移动,使其成为观察无标记过程的理想选择。

宽场成像是捕捉快速、大规模事件的主要选择,但以下数据(视频 2)清楚地表明,在某些限制条件下,共聚焦成像也可以实现可比的高帧率,但提供了更好的光学切片能力。Mica 同时获取所有标签的能力消除了由于多个标签导致的帧率降低,并防止了时空不匹配。

视频 2: 使用宽场和共聚焦显微镜对斑马鱼心脏进行的比较成像。通过宽场(a)和共聚焦(b)显微镜对斑马鱼心脏的单个光学平面进行的时间推移成像。虽然宽场成像以每秒 10 帧(fps)的速度进行,低于其最大容量,但共聚焦设置经过优化以提高速度,以减少视场(FOV)和较低分辨率下以每秒 23 帧进行成像。青色表示血管,品红色表示红细胞。

体成像

捕获三维信息(z 堆栈)需要稳定的幼虫,以防止运动引起的数据混乱。因此,快速采集至关重要。Mica 通过同时捕获所有荧光通道来加速成像过程,减少运动引起的伪影的可能性,并加快数据采集速度。

视频 3:斑马鱼幼虫的体积宽场成像。青色表示血管,品红色表示红细胞。

Mica 提供了一键切换模式的功能,直接在现场进行,无需将样本转移到新系统。这一能力使得可以使用最适合成像任务的模式。

视频 4: 宽场、THUNDER、共聚焦和 LIGHTNING 的比较。虽然宽场(a)成像速度快,并且已经揭示了许多细节,但由于该模式固有的失焦模糊,一些结构信息仍然隐藏。THUNDER(b)减少了失焦信息并增强了对比度。然而,共聚焦成像(c)提供了更优越的光学切片。通过使用 LIGHTNING,共聚焦图像可能进一步改善。

结论

Mica 是一个多功能且强大的成像系统,为使用斑马鱼作为模型生物的研究人员提供了几个关键好处,包括:

  • 高效定位自由移动的幼虫
  • 快速的多色成像,通道之间没有时空不匹配
  • 在宽场和共聚焦之间无缝切换,以迅速适应成像需求。

Mica 大大增强了斑马鱼研究的能力,克服了传统成像挑战,同时使复杂生物过程的详细观察成为可能。

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