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通过 11 种颜色的光谱分离实现超多标记

利用共聚焦显微镜的扩展光谱能力和多色混色工具

[Translate to chinese:] Spectral separation of 11 fluorophores coupled to polystyrene beads on a STELLARIS confocal system. Spectral_separation_of_11_fluorophores_coupled_to_polystyrene_beads.jpg

荧光显微镜是生命科学研究的基本工具，随着细胞组织和模式生物多色标记策略的发展而不断发展和成熟。分子特异性标记多种物种的能力需要适当的工具来识别样品中的多种荧光标签。严格分离多个标签对于获得有意义的成分、丰度、结构和功能读数至关重要。这种所谓的超多标技术在揭示组织组织、癌症进展、肿瘤免疫相互作用和传染病机制等关键方面已变得十分突出 [1-4]。

为什么需要超多标？

简单的多色实验最多使用三种不同的荧光团，它们在可见光谱的蓝色、绿色和红色区域有不同的发射。然而，生物样本和过程的复杂性不断增加，这就在技术和应用方面提出了更高的要求，需要能在中倍数（大于 10 个荧光团）范围内同时成像的方法 [5-7]。

挑战

实现多重化的一种方法是使用上述蓝、绿、红荧光团对样品进行迭代染色和成像。然而，这一过程非常耗时，而且由于每轮染色都需要进行苛刻的处理，可能会影响样本的完整性和质量。此外，合并数据的图像处理也很麻烦，尤其是在三维组织样本中。因此，在更复杂的多重染色应用中，在一轮染色中达到所需的多重染色水平的策略已成为理想选择。虽然纯粹从样品制备的角度来看，增加样品中不同荧光团的数量是研究人员可以完成的任务，但如何处理多个荧光团激发或发射光谱的重叠问题，即使对经验丰富的研究人员来说也是一项挑战。荧光团的交叉激发和发射光谱的串扰或透射使得区分不同信号变得尤为困难。因此，样品上每增加一个荧光团，都会增加正确分离每个标签的难度。

研究方法

STELLARIS 共聚焦平台就是为这些应用而设计的。下一代 WLL 超连续激发、AOBS、优化的光束路径和多达 5 个 Power HyD 探测器同时工作，实现了超灵活的光谱能力，确保最大限度地收集来自每个相关标记的光子。 集成在 ImageCompass 用户界面中的光谱非混合工具使复杂荧光团组合的分离成为可能。 

例如，我们概述了在一轮染色和成像中对 11 种不同荧光团进行成像的一种方法。我们定义了一组光谱不同的荧光团，并通过 STELLARIS 中的线性非混合通道染料分离工具将其分离。为了说明这种方法是如何工作的，我们选择了11种Alexa Fluor（AF）染料，范围从AF 405 nm到AF 790 nm（图1），与链霉亲和素连接。然后，我们将每种荧光团与涂有生物素的聚苯乙烯珠子耦合，纯化珠子，并将它们的混合物装入 Prolong Diamond 玻璃盖玻片上。使用配备了 5 Power HyD 检测器的 STELLARIS 显微镜对 11 色样品进行成像（图 2）。

本文使用的与珠子耦合的 Alexa Fluor 染料的激发光谱（A）和发射光谱（B）。

图 1：本文使用的与珠子耦合的 Alexa Fluor 染料的激发光谱（A）和发射光谱（B）。光谱由 FPbase [8] (www.fpbase.org)生成。

（A）11 色微珠（标称直径 0.8 微米）样品的原始图像；（B）利用 STELLARIS 中集成的染料分离工具获得的图像。
图 2：（A）11 色微珠（标称直径 0.8 微米）样品的原始图像；（B）利用 STELLARIS 中集成的染料分离工具获得的图像。AF 405（蓝色）、AF 532（灰色）、AF 594（橙色）、AF 750（青色）、AF 488（浅绿色）、AF 555（黄色）、AF 647（洋红色）、AF 790（红色）、AF 514（绿色）、AF 568（紫色）、AF 700（浅黄色）。

为了评估染料分离的效率，我们量化了不同通道中单个珠子上每种荧光团的串扰（图 3）。在理想情况下，每个珠子只出现在一个通道中，因为我们只用一种荧光团标记它们。为了量化，我们使用了嵌入 Fiji 自动阈值处理功能的最大熵算法 [9] [10]，对每个通道（图 3B 中显示为品红色）的对象（珠子，图 3A）进行了分割，并测量了所有通道的归一化平均强度。归一化平均强度值显示在直方图中（图 3C）。我们的分析证实，每个荧光团都被分配到一个通道，11 个不同标记的珠子可以清楚地分成各自的通道。

评估 11 色珠样品图像中的染料分离效率。
图 3：评估 11 色珠样品图像中的染料分离效率。使用染料分离工具成像后获得的通道（A）使用 MaxEntropy Dark 进行了阈值化和分割（B）。计算不同通道之间的串扰，并绘制每个通道的串扰图 (C)。

Video: 11-color beads sample imaged with STELLARIS and the dye separation integrated tools. The biotin-coated beads (nominal diameter 0.8 micron) were labeled with streptavidin coupled to Alexa Fluor dyes. See Figure 2.

结果

总的结果是成功地对与合成珠耦合的 11 种不同荧光团进行了光谱分离，证明了 STELLARIS 共聚焦平台如何为多重应用提供了独特而强大的机会。

参考文献

  1. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Radtke, A. J. et al., PNAS, 2020. doi: 10.1073/pnas.2018488117.
  2. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Stack, E. C. et al., Methods, 2014. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016.
  3. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Tan, W. C., et al., Cancer Comm (Lond), 2020. doi: 10.1002/cac2.12023.
  4. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Lewis, S. M.,et al.,  Nat. Methods, 2021. doi: 10.1038/s41592-021-01203-6.
  5. Spectral Imaging and Linear Unmixing in Light Microscopy. Zimmermann, T., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2005. doi: 10.1007/b102216.
  6. Hyperspectral phasor analysis enables multiplexed 5D in vivo imaging. Cutrale, F., et al., Nat. Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4134. 
  7. PICASSO allows ultra-multiplexed fluorescence imaging of spatially overlapping proteins without reference spectra measurements. Seo, J., et al., Nat. Comm., 2022. doi: 10.1038/s41467-022-30168-z.
  8. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Lambert, T. J., et al., Nat. Methods, 2019. doi: 10.1038/s41592-019-0352-8.
  9. A new method for gray-level picture thresholding using the entropy of the histogram. Kapur, J. N., et al., Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 1985. doi:10.1016/0734-189x(85)90125-2.
  10. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Schindelin, J., et al., Nat. Methods, 2012. doi:10.1038/nmeth.2019.

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