为什么要使用多参数显微镜？
生物医学研究领域的荧光显微镜通常关注一系列不同颜色发射的相关性。不同的颜色代表特定染色的结构或代谢参数。生物学是研究生物体的科学，而生物体即使在微观尺度上也在运动。这一事实不仅适用于快速移动的原生动物，也适用于被认为是静态的个体，如植物。细胞区室、蛋白质和代谢分子通常用不同颜色的荧光标记物进行标记。多光子显微镜增加了其他选项，如二次和三次谐波生成。这些颜色通道最好是同时记录，即并行记录，以保持它们在高度动态变化的环境中的相关性。通过这种方式，同时记录保留了被研究生物参数之间的时间和空间相互关系，并且提高了时间分辨率。这需要多个光传感器用于不同的颜色通道，这些传感器并行工作，并同时提供相关光谱的光的分数。
替代方案是顺序记录，其中为不同的光谱分数提供一个单一传感器，依次记录每个分数的图像并随后叠加。使用顺序方法，不仅可能会丧失空间和时间的相关性，而且时间分辨率也降低，降低的幅度至少等于记录参数的数量。因此，整个数据采集所需的时间要长得多：按相同的比例。
同时记录光谱发射分数的经典解决方案是使用二色光束分割镜和阻挡滤光片的排列。这种设计的缺点是，对于更改的染料组合，系统必须提供适当的滤光配置，使其成为一种成本高、速度慢且不灵活的解决方案。
可调多波段检测
对于单通道系统，这种不灵活性通过使用光谱设备——光谱仪被消除了。1997 年，徕卡激光技术公司推出了第一款具有自由可调检测通道的多通道光谱设备，允许共聚焦显微镜同时记录不同颜色的图像：SP 探测器。[1]
该 SP 探测器解决方案用于共聚焦显微镜，采用一个棱镜将检测光分成其光谱成分，并通过一组级联光谱仪狭缝将可调带传递到传感器。电动屏障由反射镜制成，因此可以将互补部分进一步引导到传感器上。通过这种方式，完整的光谱可以被切割成多个部分，每个部分可以进行微调，以实现通道的最佳分离，而无需进行复杂的计算。这个概念依赖于共聚焦显微镜中发射光束是静止的这一事实。扫描运动通过扫描镜进行补偿，发射的光以相反的方向经过这些镜子。然后，静止的光束通过检测针孔，生成光学切片。
然而，在多光子显微镜中，光学切片是通过光子的非线性相互作用产生的，这种相互作用在焦平面上具有足够的密度。因此，不需要针孔，发射的光可以在通过扫描设备之前被检测到，即非扫描检测。这种方法对于成像深处的浑浊物体（如许多生物样本）尤其重要，因为它们表现出显著的散射，导致光子损失。使用非扫描探测器，收集效率大大提高，图像更加清晰，研究人员可以更深入地观察标本。然而，这一概念没有静态光束，这导致光谱在棱镜和光谱仪狭缝上晃动，从而导致位置依赖的光谱响应。
渐变选项
到目前为止，非扫描探测器中各种发射通道的分离是通过二色镜和具有固定光谱规格的阻挡滤光片来实现的。当实验设置发生变化时，滤光片也需要更换。没有办法通过不断改变滤光片参数来优化性能。一个明显的解决方案是用梯度元件替换光谱固定元件。与普通的二色分光器和滤光片不同，梯度元件在一个空间维度上具有光谱变化。简单的颜色渐变滤光片通常用于效果摄影，但也有高性能的介电滤光片和分光器。当梯度滤光片在光束周围移动时，出射光束的光谱特性可以不断调节。因此，梯度滤光片被随意称为“可变滤光片”。图 1 展示了这一二色光束分割的原理，短通或长通滤光也类似适用。
图 1： 用作可调（可变）二色分光器的梯度二色器的性能。左：发射（E）通过可变二色分光器 VDS 分成两个颜色带。反射（R）到透射（T）的切换发生在较长波长（λ）处。右：当移动 VDS 的位置时，R 到 T 的切换发生在较短波长处。
到目前为止，一切都很好。但新的挑战
尽管我们可以通过梯度滤光片构建一个具有可调光谱检测通道的非扫描探测器，但扫描显微镜需要一个巧妙的设计来进行设置。扫描光束的角度和位置变化以及梯度介电光学滤光片的特性导致了这种设计的需求。接下来的两个部分将讨论这两个方面。
在瞳孔平面（参见图 3 中的 P），它与显微镜物镜的后焦平面重合，位置是固定的，但角度随着扫描过程不断变化。这个关系被用来方便地扫描样本，而不需要移动标本或光源。扫描镜被放置在与后焦平面共轭的平面中。当扫描时，镜子改变光束角度，这会导致焦平面中的位置变化。
在任何像 G 这样的平面中，位于 F 和 P 之间，角度和位置都随着扫描而变化。
滤光器特性
不同设计的滤光器表现不同，具体取决于它们的位置和角度（见图 4）。
颜料滤光片： 对于传统的颜色滤光片，通常是含有颜色颜料的玻璃片，光束通过滤光玻璃的位置对光谱性能没有影响。当以非垂直方式照射这样的滤光片时，光在均匀材料中通过的距离变长。因此，透过率降低。
干涉滤光片： 由一个空的玻璃基板组成，表面涂覆有特定顺序的介电材料层，因此也被称为介电滤光片。这些层会导致通过的光线之间发生干涉。层的厚度和材料成分的组合使得过滤作用得以实现，允许光谱中所需的部分通过滤光片，而相应的部分则被反射。未在垂直照明下操作的干涉滤光片可以收集传输和反射的部分。在这种情况下，滤光片被称为二色镜。对于均匀涂覆的滤光片和二色镜，照明位置对传输光没有影响。然而，入射角的变化会导致二色镜的颜色发生显著变化。通常它们在约 45°的入射角范围内操作。对于在垂直入射下操作的干涉滤光片，变化可以忽略不计。
梯度干涉滤光片： 具有与均匀干涉滤光片相同的特性，但颜色响应沿一个空间方向变化。因此，透过率依赖于入射角和在梯度方向上的位置。对于扫描显微镜来说，这种解决方案似乎是最糟糕的，因为在光束的任何位置扫描时，光谱特性都会发生变化。
因此问题出现了：是否有办法在非扫描光束路径中使用梯度滤光片进行多通道检测，尽管存在所有这些颜色效应？
问题 + 问题 = 解决方案
如果我们将梯度滤光片放置在与场共轭的平面中，那么由于变化的位置我们将会有颜色变化。在与瞳孔共轭的平面中，由于变化的角度我们将会有颜色变化。
但是，如果我们将滤光器放在一个合适的位置（图 3 中的位置 G），并且如果我们合理设计滤光器涂层，那么我们可以使这两种效果相互抵消 [2]。光束路径和滤光器的设计计算有些繁琐，但最终会得到一个实用的解决方案。这些结果是通过徕卡微系统的 4Tune 探测器实现的。
徕卡显微系统的 4Tune 探测器采用上述技术。SP8 DIVE 中集成了梯度二色镜和滤光片，提供四个可自由独立调谐的光谱通道，用于多光子显微镜中的非扫描检测。用户可以在直观且整齐排列的图形软件界面中轻松定义所需的波段。该界面允许用户在荧光中设置光谱波段，以获得最佳效率和通道分离。它还允许在更改照明波长时无缝调谐第二或第三谐波的检测，同时进行荧光记录。
参考文献：
- Engelhardt J: Device for the selection and detection of at least two spectral regions in a beam of light. World Patent WO 1995007447 A1, priority Sep. 8th (1993).
- Gugel H, Neugart F and Böhm I: Scanning Microscope. World Patent WO 2016 / 198694 A1, priority June 11th (2015)
