介绍
光电联用技术（CLEM）是一种成像技术，可以利用光学显微镜识别和定位靶向荧光标记，然后利用电子显微镜进行近纳米分辨率的成像。对于电子显微镜无法追踪到的罕见事件，CLEM特别方便。两种成像模式的结合非常有吸引力。如果光学显微镜性能不足，电子显微镜能迅速提供帮助。电子显微镜的分辨率约比传统光学显微镜大两个数量级，此外，电子显微镜提供了所需的参考空间，可以目测标记和未标记的结构。虽然目前CLEM在宿主-寄生虫研究中的使用并不常见，但它满足所有标准，是可视化和研究感染过程的有价值方法，特别是少量寄生生物即可引起疾病的情况下。
我们利用CLEM研究了伯氏疏螺旋体与几种神经源哺乳动物细胞系之间的相互作用。螺旋体细菌——伯氏疏螺旋体是一种人畜共患病原体，其感染周期在蜱类节肢动物媒介和脊椎动物宿主之间交替变化。伯氏疏螺旋体可通过蜱虫叮咬传播给人类，引起莱姆病相关临床表现。我们旨在研究伯氏疏螺旋体入侵非吞噬细胞的趋势，但围绕此问题仍然不清楚。同时，我们希望找到一种快速、直接的方法来消除与室温下样本制备相关的伪影，如化学固定和脱水等 [1]。为此，我们采用了新的 徕卡 EM Cryo CLEM 系统。使用该系统采集的荧光图像与同样在冷冻温度下，通过扫描电子显微镜获得的图像相关。这些条件下的成像可确保样本的最佳保存，使其接近自然状态。
结果
为了检测和更全面地表征病原体进入宿主之前的事件，首先应能够在宿主表面追踪此病原体。为尽快达到此目的，可选择使用光学显微镜。我们使用了 徕卡 EM Cryo CLEM 装置、带有冷冻载物台的荧光显微镜、液氮冷却的冷冻传送梭和特殊的冷冻载物台。
在玻璃化样品上使用荧光显微镜的重要前提是在物品发生玻璃化前，将荧光标签加到感兴趣的物体中。我们使用携带稳定表达GFP报告基因的伯氏疏螺旋体 [2]。将神经细胞接种到蓝宝石盘（徕卡显微系统）上，然后加上伯氏疏螺旋体。在此之前，为了实现定向，将透射电镜格线（EMS）放置在碳包覆的蓝宝石盘上。它促进了使用电子显微镜对感兴趣的细胞-病原体相互作用的定位。
细胞通常生长得非常致密（图1A），因此寻找感兴趣的宿主细胞-细菌相互作用将相当困难。因此，在蓝宝石盘上创建了格线图（图1B）。在找到感兴趣的相互作用并使用冷冻荧光显微镜捕获图像（图1C）后，冷冻扫描电镜提供了更高的兴趣点分辨率或者参考空间（图1D）。
图1：在碳标记的蓝宝石圆片上（A）人胶质瘤细胞和（B、C、D）小鼠神经母细胞瘤细胞表面生长的伯氏疏螺旋体-GFP (绿色)的相关冷冻荧光和冷冻扫描电镜。将细胞用Hoechst 33342（蓝色）和LysoTracker（红色）反染。
参考文献
- Dubochet J, and Sartori Blanc N: The cell in absence of aggregation artifacts. Micron 32: 91–99 (2001).
- Dunham-Ems SM, Caimano MJ, Pal U, Wolgemuth CW, Eggers CH, Balic A, and Radolf JD: Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. J. Clin. Invest. 119 (12): 3652–65 (2009).
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