如何量化单细胞代谢状态的变化

许多代谢成像方法的一个缺点是依赖标签来追踪代谢变化。宏观方法，如 PET，使用放射性标签或示踪剂。显微镜方法通常依赖于荧光探针。遗憾的是，从探针测量的荧光强度可能是不一致的——值取决于数据收集的方式、探针的浓度以及探针穿透样本的程度，这可能需要固定和灌注。此外，一些探针对细胞有毒，可能与细胞无特异性结合，或者会破坏组织中的生化和生理条件。这些特性影响结果并使重复测量变得不可能。荧光寿命成像（FLIM）提供了一个另一种选择：无标记代谢成像是一种可行的微创工具，可用于研究代谢模式。

代谢成像的新维度

与测量荧光团在激发后返回基态时发出的光强度不同，FLIM记录了荧光团保持在激发状态的平均时间。该时间间隔是荧光团的独特属性，受到通过结合或与其他分子的相互作用导致的荧光团构型变化的影响。

通过FLIM进行的无标记代谢成像使用的是自发荧光的代谢酶辅因子，如NADH。细胞NADH水平随着新陈代谢的变化而变化。与偏重氧化磷酸化的细胞相比，偏重糖酵解的细胞中 NADH 与其氧化对应物 NAD+ 的比例更高。相反，这个还原-氧化比率与游离NADH与蛋白结合NADH的比率相关，这是一个FLIM可以检测的构型差异。游离NADH的荧光寿命(~0.4纳秒)显著低于蛋白结合NADH的荧光寿命，提供了关于细胞代谢状态的功能性信息，沿着从一端的糖酵解到另一端的氧化磷酸化的现象谱（图1）。

FLIM 与 STELLARIS 8 DIVE 等多光子显微镜相结合，在活细胞和厚组织切片的无标记代谢成像方面具有优势。多光子显微镜用红外波长激发荧光团，而非单光子激发所用的紫外线光，因为后者会对活细胞造成光毒性。多光子显微镜焦深大但焦体积小，有助于实现深组织成像，且离焦荧光极少，从而补充了 FLIM 在高分辨率和高精度记录自发荧光物种低水平信号方面的灵敏度。最后，荧光寿命不受探针浓度、光漂白、光散射或激发光强度的影响——它是一个不受强度测量限制的正交维度，可扩展从图像中提取的信息。

TauContrast是STELLARIS 8 DIVE上的一种TauSense成像工具，它根据每个像素的平均光子到达时间和光子计数数量（强度）生成图像。其结果是对反映代谢状态的组织微环境变化的详细可视化。然而，TauContrast并不量化荧光寿命，因此无法报告游离与结合NADH的比例。量化是通过将一个数学模型拟合到光子到达时间的直方图来完成的，该直方图描述了 NADH 荧光寿命的指数衰减（图 2）。该曲线是由两个指数衰减（来自游离和结合NADH）组合而成的，因变化和仪器响应函数而产生偏差。因此，这种复杂的定量方法需要经验丰富的专家来进行解读。但是还有一种更好的方法。

相位分析通过消除对复杂衰减指数建模的需求，使非专业人士能够快速轻松地获取可量化的代谢信息。在相位分析中，图像中每个像素的荧光寿命信号通过傅立叶变换转换成频率分量——相位——并在相位图（图 3）上绘制。相位分析的强大之处在于其基于负和正对照的可解释性。这些对照位于相位图的外边缘，或称为“通用圆”。在基于NADH的代谢成像中，对照是纯游离NADH和纯蛋白结合NADH。图像中每个像素的相位体来自这两种NADH状态的混合，因此，落在两个对照之间的线上。这条线被称为“代谢轨迹”。通过观察像素相位在图上的位置，可以计算每个像素相对于结合NADH的游离NADH浓度。更进一步，组成图像中细胞的所有像素的平均相位体是细胞的相位指纹，它沿着代谢轨迹表征了细胞的状态。

利用相位分析，无需进行数学建模，结果对探针不敏感，因此任何实验室，无论是否具有专业知识，都可以使用代谢成像技术。相位图也是一种强大而直观的化学物质或细胞相量指纹的可视化方式，使结果的呈现和比较更加容易。最后，在相位图上选择感兴趣的区域可以映射回图像，将这些信号定位到细胞或亚细胞区域。

作为一个完全集成的用于 FLIM 的多光子显微镜系统，STELLARIS 8 DIVE FALCON 凭借先进的显微镜功能增强了 FLIM 的能力，允许以视频速率的帧速进行平铺扫描和 3D 采集。至关重要的是，STELLARIS 8 DIVE FALCON 将 FLIM 应用（如代谢成像）从复杂的专业技术转变为广泛可用、易于使用的工具，通过相位分析来收集和解释 FLIM 数据。以下研究举例说明了使用相位分析来关联代谢和细胞行为。

代谢状态预测分化潜力和方向

细胞和干细胞（NPSCs） [2]以及小肠隐窝上皮细胞 [3]的代谢和分化状态。在这三项研究中，单个细胞的相量指纹与细胞的分化状态及其对特定分化途径的承诺相关。在秀丽隐杆线虫中，细胞相量指纹的不同簇与生殖细胞的梯度排列一致，从远端未分化的“干细胞样状态”向近端更分化的细胞过渡 [1]。未分化的 NPSCs 表现出糖酵解表型，游离/结合 NADH 比例高，而分化的神经元倾向于氧化磷酸化，其特征是游离/结合 NADH 比例低。此外，基于相量指纹，NPSCs 可以被分类为神经祖细胞或神经胶质祖细胞，因为后者位于代谢轨迹的氧化磷酸化一侧更远的位置 [2]。在小肠组织隐窝内衬的上皮细胞中，代谢和分化状态的类似排列也很明显。隐窝底部的干细胞具有明显的糖酵解作用。从隐窝到表面的分化细胞的相位指纹逐渐转向氧化磷酸化 [3]。

代谢成像作为高通量药物筛选的工具

一个无损跟踪活细胞对外部刺激的代谢反应的系统可能构成体外高通量药物筛选的有效工具。在 2016 年的一项研究中，Datta 及其同事提供了利用 FLIM 和相位分析实现这一目的的概念验证 [4]。该团队通过限制培养氧气水平或使细胞暴露于已知会产生氧化应激的抗癌药物（顺铂）或抗病毒药物（AZT）来引发心肌细胞缺氧。所有这三种处理方法都会导致相位图中游离与结合 NADH 的比率升高，从而导致新陈代谢转向糖酵解，类似于使细胞暴露于 KCN（一种关闭氧化磷酸化的毒物）。

了解癌细胞中的蛋氨酸代谢

大多数恶性癌细胞表现出蛋氨酸依赖性代谢表型。与非致瘤细胞不同，它们在蛋氨酸被同型半胱氨酸取代的生长培养基中无法增殖。

Borrego 及其同事使用 FLIM 和相位分析来检查乳腺癌细胞系和衍生的克隆细胞系之间的代谢差异，结果表明后者对蛋氨酸依赖性具有抗性，并失去了典型的致瘤转化表型 [4]。在蛋氨酸培养基上生长时，两个细胞系都表现出相似的代谢谱，约 80％的 NADH 信号代表低游离/结合 NADH 比例。转移到同型半胱氨酸培养基后，抗性克隆细胞系进一步向糖酵解转变，低游离/结合 NADH 比例仅为 64％，而原始细胞为 70％。抗性克隆可能对氧化磷酸化的依赖较小，因此对蛋氨酸应激更具耐受性。

检测氧化应激的生物标志物

FLIM 相位分析还能检测氧化脂质，它们在相位图上表现为长寿命物种（LLS） [6]。这些 LLS 是氧化应激的生物标志物，在 Datta 等人研究的心肌细胞中，当暴露于缺氧和应激诱导药物时就会出现[4]。同样，Borrego 等人研究中的蛋氨酸依赖性癌细胞系显示出 LLS 的生成增加[5]。在正常生长条件下，与原始细胞系相比，对蛋氨酸依赖具有抗性的克隆细胞系的 LLS 平均比例更高（22% 对 7%）。然而，转移到同型半胱氨酸培养基后，原始细胞系中的这一比例增加了 29%，而克隆细胞系仅增加了 5%，这暗示了 LLS 可能具有保护功能。这两项研究都提出了在相位图上可见的氧化应激轨迹，作为检查氧化在癌症、动脉粥样硬化和心脏病中的作用的一种方法。

总结和结论

带有相位分析的无标记 FLIM 为探索细胞和组织的动态环境及功能开辟了有趣的可能性。摆脱了探针的限制和复杂的模型拟合，采用相位分析的 FLIM 还远远超出了 NADH 的范围。Stringari 记录了其他内源性荧光团（包括 GFP、FAD、视黄醇、视黄酸、胶原蛋白和原卟啉 IX）独特的相量指纹 [1]。通过相位分析简化 FLIM 数据的收集和解释，STELLARIS 8 DIVE FALCON 轻松地将这些相量指纹转化为可量化的标记，以跟踪单细胞或整个组织中代谢、3D 微环境和信号通路的变化。此外，Cao 及其同事展示了尽管存在光谱串扰，但仍能同时测量两种内源性荧光团，这极大地扩展了分析的可能性 [7]。带有相位分析的 FLIM 是一种强大而稳健的方法，用于检查细胞和亚细胞水平的生化和生理动态。这种以前仅限于在复杂实验设置和数据建模方面有经验的专家显微镜学家的方法，现在通过 STELLARIS 8 DIVE FALCON 使代谢成像成为每个科学家、每个实验室和每个想法的研究工具。

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