如何在块面中自动获取感兴趣的荧光细胞

透射电子显微镜和扫描电子显微镜（TEM 和 SEM）等电子显微镜被广泛用于深入了解生物样本或材料的高分辨率结构。

超薄切片技术是获得小于 100 nm的薄片，以便在 TEM/SEM 中进行表征的最常用方法。在室温下制备样品时，先将小块样品嵌入环氧树脂或丙烯酸树脂中，然后通过修整去除多余的树脂，再用玻璃刀或钻石刀将样品切成超薄切片（50 nm-100 nm）。

修整过程是一个重要步骤，可去除过多的无样品树脂，暴露标本，并获得包含感兴趣区域或细胞的块面，以便进行后续切片。

在当前的标准工作流程中，使用配备的标准体视显微镜的设备，并不能在超薄切片机上直接识别实际的目标区域。取而代之的是，对切片进行染色，并将其转移到放大倍率更高的外部宽场显微镜上，以检查是否已到达标本的目标平面。之后还必须对超薄切片机进行繁琐的调整，以确保切片时不会丢失样品。

为了避免这些费时费力的转移和重新调整，最好能在超薄切片机上直接识别目标区域。荧光标记是一种标记目标区域的方法，并使用丙烯酸聚合物保留树脂内荧光，可用于 制备EM 样品。

为了填补这一空白，需要一种在修整和切片过程中提供在细胞分辨率上荧光观察的超薄切片机。配备了用于荧光成像的 M205 FA 的徕卡自动超薄切片机 UC Enuity 正好提供了这一解决方案。

在这里，我们将展示如何使用 UC Enuity 来识别感兴趣的荧光细胞，如何自动修整包含感兴趣细胞的块面，以及如何在不转移到外部显微镜的情况下在切片中观察感兴趣的细胞。

室温样品制备首先要将样品嵌入树脂中。荧光标记是标记目标区域的一种方法。

制备带有荧光信号的细胞有多个步骤，包括细胞培养、固定、高压冷冻、脱水和嵌入丙烯酸树脂。

典型的丙烯酸树脂如 LR White（室温浸润和加热聚合）或 Lowicryl TM HM20（用于冷冻置换和在紫外线下聚合），其具体使用方法查阅相关说明文件。

使用丙烯酸树脂的好处是可以充分保留超微结构，同时具有良好的抗原性和/或荧光能力

为了在 TEM 中获得良好的超微结构并保持荧光，我们开发了高压冷冻和冷冻替代方案：

例如
斑马鱼胚胎低温固定及相关光学、电子显微镜和断层扫描方法。
Nixon, S. J. et al. 2009
Traffic 10 (2), 131–136. doi:10.1111/j.1600-0854.2008.00859.x

或
具有高灵敏度和空间精度的相关荧光和三维电子显微镜研究。
Kukulski, W. et al. 2011
J. Cell Biol. 192 (1), 111–119. doi:10.1083/jcb.201009037

此外，还有一篇关于该主题的评论，其中包括所有相关的其他作者：

人人为我，我为人人：近距离观察用于 CLEM 的染色质内荧光方案。 
Heiligenstein X. et al.
Front Cell Dev Biol. 2022 Jun 30;10:866472. doi: 10.3389/fcell.2022.866472. PMID: 35846358; PMCID: PMC9280628.

为了支持在超薄切片机上进行识别、修整和切片，所使用的体视显微镜需要满足特定的光学要求。下面将讨论一些光学方面的问题。

放大率和分辨率

超薄切片机配备有体视显微镜，可放大感兴趣的区域，同时保持三维感觉，以便在修整和切片时精确处理样品和刀具之间的关系。根据物镜和目镜的不同，放大倍数从 6.7 倍到 77 倍不等。

由于许多哺乳动物培养细胞在基底上的直径约为 10 微米，因此光学系统的分辨率至少应为 5 微米，才能分辨出单个细胞（遵循奈奎斯特频率）。如果细胞相互连接，不能很好地分离，因此这一点就尤为重要。

徕卡 UC Enuity 可配备用于非荧光应用的体视显微镜 M80 或用于荧光应用的 M205 FA。”80 "或 "205 "分别代表 8 或 20.5 的变焦范围。

因此，用于荧光应用的 M205 FA 型体视显微镜使用标准的 0.63x 镜头，可提供 7.8x 至 160x 的无级放大倍率，工作距离为 9.7 厘米。同时，从 25 微米到 3 微米不等的分辨率能够分辨明场和荧光中的单个细胞，甚至还能分辨亚细胞模式，如线粒体染色模式（图 1）。

体视显微镜的荧光功能

要在体视显微镜上进行荧光成像，会遇到许多挑战，徕卡显微系统公司已经解决了这些问题。由于激发光通常比发射光亮几个数量级，为了摆脱激发光影响，徕卡采用了获得专利的 TripleBeam 技术，在该技术中，激发光被反射到远离发射光路径的地方。这样就可以对试样进行荧光观察，而不会产生反射，并且对比度高，这对精确修整至关重要（TripleBeam 技术）。

荧光强度

根据目标分子上所附荧光团的数量，信号强度会有很大的不同。如果在标准宽场显微镜中无法观察到样品，那么在物镜开口角度有限的体视显微镜中也无法观察到样品。尤其是在超薄切片机上，为了不接触或损坏刀具或样品，工作距离必须达到几厘米。这就需要在放大倍率、开口角度（数值孔径）、工作距离和集光效率之间取得良好的平衡。在配备 M205 FA 的 UC Enuity 上，0.63x 物镜的工作距离接近 10 厘米。

如果肉眼难以观察到信号，可以通过将数码相机的曝光时间延长到 ½ 秒或更长的时间来观察微弱的信号。不过，荧光强度是否足以在超薄切片机上可视化并用于（自动）修整，这在很大程度上取决于样品。

在下文中，我们将展示使用配备 M205 FA 的自动超薄切片机 UC Enuity 的示例工作流程，包括荧光靶细胞的可视化和选择，以及包含荧光靶细胞的切片。目的是观察完整的细胞，即直接进行膜染色，并保持操作简单。为保持特定的细胞内荧光结构，应使用上述方案，包括高压冷冻和冷冻置换。

在蓝宝石上培养荧光细胞

哺乳动物细胞在蓝宝石上过夜生长。蓝宝石上涂有碳膜栅，用于调整自动冷冻置换系统（Leica EM AFS2）流动室中的方向。细胞用 CellTracker TM Green（Thermofisher）染色，并用 2% 戊二醛进行化学固定。蓝宝石被转移到 EM AFS2 中，并用浓度越来越高的乙醇自动脱水。使用 Lowicryl TM HM20 进行渗透和聚合。然后将蓝宝石从树脂中取出，以便对细胞进行切片。

了解标本概况

将样品装入 UC Enuity 后，以明场明场和荧光模式（GFP 滤光片：激发 450 - 490 nm，发射 500 - 550 nm；图 2）观察样品表面。

借助 Mesacut 镜改进样品可视化

为了在刀和样品之间留出光隙以便对准，并在切片过程中获得水槽上的水面反射图像，M205 FA 立 体显微镜的安装角度为 20°。因此，无法从正面观察样品表面。

为了获得正面视图，可以使用一种灵活的镜子，即 Mesacut 镜（mesa = 台山）（图 3）。镜子的角度是灵活的，用户可以根据自己的需要进行调整。

为自动修整定义块面参数

要将样品自动修整到所需的块面，必须定义六个不同的参数（图 4）。UC Enuity 的软件工作流程可指导用户设置参数。

首先，需要输入修边刀的宽度，以确保修边刀覆盖最终的砌块面尺寸。其次，必须设置修块刀的倾斜角度。在这一步中，UC Enuity 会自动计算使用 45° 倾斜角刀具时的 X 方向刀位。第三，需要设定所需的块面宽度和高度。其次，必须设置修边深度，以确定最初应修整掉多少树脂，直至达到最终的块面。最后，必须设置最终块面的侧面修整深度。图 5 显示了软件引导用户通过自动修整工作流程定义输入值的一个示例截图。

为自动修边定义块面边缘

设置数值后，必须确定样本上块面的绝对位置。具体方法是将刀具的左边缘设置为所需块面的右边缘，该块面包含目标结构，即一组标有白色感兴趣区的细胞（图 6；注：由于这是 Mesacut 镜像视图，因此在图像的顶部可以看到刀具）。然后将样本顺时针旋转 90°，并设置块面的下边缘（图 7）。最后，根据软件工作流程中的数字输入值计算出块面尺寸（图 8）。

由于在细胞生长在蓝宝石上，细胞位于块面表面的正下方，因此无需去除正面的材料。

附注：为了接近树脂深处的目标平面，可以使用共聚焦显微镜或微型计算机断层显微镜（µ-CT）创建的样品三维数据。UC Enuity 提供了一个软件流程，可直接加载样品的三维渲染图，用于靶面修整。注：可使用此技术修整目标平面，而无需修整过程

在自动修边过程中，无需用户交互，即可创建最终的块面。自动过程包括根据定义的位置定位刀具和树脂块、切割定义的修边深度以及旋转树脂块。这样，用户就可以腾出宝贵的时间从事其他活动。

自动修整过程的结果

图 9 显示了自动修整过程的最终结果。荧光目标细胞组位于块面的中心（白色箭头），根据输入值去除树脂边缘。

 

在自动切块修整后，我们对块面进行了切片，以证明配备 M205 FA 的 UC Enuity 可以在切片中看到荧光靶细胞。经过切片后，在第一个完整切片中已经可以看到细胞（图 10）。

在这篇文章中，我们了解到树脂内荧光可用于在块面和切片上的细胞定位。此外，我们还展示了安装在 UC Enuity 上的 M205 FA 能够完美地分辨单个细胞，甚至是亚细胞结构。这就避免了在接近目标平面时转移到其他显微镜的繁琐过程，从而降低了样本丢失的风险，并减少了修整和切片的时间。UC Enuity 软件工作流程可帮助指导整个设置过程，而全自动修整过程则可将更多宝贵时间还给用户。

当然，UC Enuity 的自动修块功能可与标准明场照明一起使用，从而在没有树脂内荧光的情况下也能获得上述优势（只要目标在没有树脂内荧光的情况下是可见的）。

随着电子显微镜，特别是体积电子显微镜的日益普及，高效高质量的修块技术变得越来越重要，以便在试样进入电子显微镜后立即快速找到目标结构。UC Enuity 的自动修块功能有助于高效地修整样品，从而最终缩短电镜表征时间，从而降低成本，并缩短获得结果的时间。

作者要特别感谢 Felix Gaedke 博士（德国科隆 CECAD）以多种方式提供样本和知识；感谢科隆 CECAD/CMMC 成像设施负责人 Astrid Schauss 博士为作者深入了解电镜工作流程提供支持。