超越反卷积

Borlinghaus, Rolf T.; Greb, Christoph; DeRose, James

March 22, 2023

超越反卷积

使用宽场显微镜获取厚生物样本更清晰的三维图像

宽场荧光显微镜通常用于视觉呈现生命科学样本中的结构并获取重要信息。利用荧光蛋白或染料，以高度特异性的方式标记离散的样本部分。为了充分了解某种结构，可能需要以三维方式呈现，但这会对使用显微镜带来某些挑战。

要创建某个结构的三维图像，必须考虑的一个因素就是光学器件的市场和景深存在限制，因此需要采集对焦区域和离焦区域的信号信息。此外，可能发生衍射。非焦光和散射光会的产生“模糊”图像。

传统上，采用反卷积技术来消除非焦光。随着成像解析技术的诞生，现在徕卡开发了一种超越反卷积的创新光电数字成像技术，可以提供更加清晰的图像以及更为逼真的三维结构显示。

问题：图像为什么会模糊？

每位荧光显微镜用户都希望对感兴趣的结构获得尽可能多的详信息。但问题在于光学系统生成真实图像的能力有限。所有光源，例如样本中的荧光蛋白，都会发出散射光。现实情况中，散射光会导致信号模糊，具体取决于样本的厚度。为了克服该问题，人们采取了不同的解决方法。

利用针孔消除非焦光

共聚焦显微镜通过在激发光和发射光通路中添加精确定位的针孔来消除离焦信息 [1]。这种方法会产生较大垂直（z）分辨率的图像（小焦深）并消除离焦信号部分。由于样本中每个显示点位（光学切片）的共聚焦体积较小 [1,2]，因此需要收集到样本的所有光学切片后，才能创建最终图像。因此，虽然有更高的分辨率，但也意味着图像采集时间更长。

宽场显微镜

传统宽场显微镜没有针孔，因此会同时收集对焦光和非焦光信号 [3]。这样可以快速采集图像，但分辨率较低。

传统解决方案：通过反卷积技术锐化图像

要弄清楚如何解决宽场图像模糊的问题，我们首先来看一个很小的样品，例如一颗圆形乳胶珠，其尺寸低于显微镜的分辨率限制。使用显微镜从水平方向观察这个3D荧光样本，观察者看到一个发光点的投影，周围一片模糊（图1）。采集z堆栈会产生以下描述：乳胶珠的侧视图类似于两个顶点对在一起的锥体。这是因为z堆栈采集过程中记录的信息来自杂散光。我们可以从信号数据中减去这些“错误”信息，从而生成能真正显示乳胶珠的图像。这种减法需要使用一种称为反卷积的数学计算 [4,5]。

图1：宽场显微镜中，点光源在横向（xy）以及垂直（xz）平面上的投影。一个极小的荧光乳胶珠代表点光源。这张宽场显微镜图像无法完美再现乳胶珠的圆形结构。由于杂散光，乳胶珠的xy轴视图会在边缘出现一定模糊。采集z堆栈信息厚，xz轴投影让乳胶珠看起来呈沙漏形。利用显微镜观察点状物体，经常会遇到这种失真现象。

点扩散函数（PSF）

为了理解此过程的基本原理，我们必须介绍一个在反卷积方面经常使用的特殊术语：点扩散函数（PSF）[4,5]。

原则上，图1中的失真现象源于光学显微镜生成点光源表示图的能力有限。光信号在穿过显微镜的镜片时会失真，具体取决于光学系统的设置、光线的波长、物镜及其数值孔径（NA）、浸没介质的折射率以及其他参数。所有这些影响因素的作用结果，即它们对于光学系统生成的最终图像的影响，称为点扩散函数（图2A和2B）。从物理学来看，你可以认为样品根据点扩散函数发生了卷积（折叠）。因此，如果我们已经知道PSF，就可以让样品按照PSF展开。这种“开展”就称为反卷积。

图2A）使用宽场显微镜拍摄的点状物体图像和z堆栈。该图像受到多个参数的影响，包括系统设置、数值孔径和浸没介质的折射率等。所有这些会导致图像失真的因素都可以使用点扩散函数（PSF）来描述。我们可以认为物体按照PSF发生了卷积。因此如果PSF已知，就可以进行反卷积。

图2B）使用共聚焦显微镜记录的极小乳胶珠的PSF。它通过在垂直（xz）平面收集的光强度生成PSF是一种衍射图案，其核心形状控制着共聚焦显微镜的光学分辨率[2]。

现在问题就是如何确定PSF？PSF一般通过计算来预估。如果知道激发光和发射光的峰值波长以及显微镜物镜的数值孔径，就可以通过计算机算法得出PSF的理论值。