用徕卡EM ACE600电子束对DNA进行甘油喷雾/铂金低角度旋转遮光

在制备过程中使用了两个电子枪，这两个电子枪都需要脱气，旨在避免在实际蒸发开始的瞬间，加热导致真空度大幅下降。无需两个后续的Pt/C和C脱气/泵送/蒸发循环，最好是先对两个电子枪脱气，然后泵送较长时间，以达到两种材料蒸发所需的良好工艺真空度。下面介绍实现此方法的自动化序列。在右端口上安装Pt/C枪，在左侧安装C枪。

• “脱气铂”物质定义为采用Pt标准设置，50 W脱气功率和120 s 的脱气时间。
• “脱气碳”物质定义为采用C标准设置，75 W 脱气功率和 300 s 的脱气时间。
• 采用与原材料相同的属性定义了“未脱气铂”和“未脱气碳”这两种物质，但脱气已禁用。

• “Pt/C脱气”处理旨在使Pt/C枪脱气，仅使用物质“脱气铂”编程。工艺设置为从 1.0 × 10^–4 的压力开始，蒸发功率低至 30 W，靶向厚度为0.0 nm ，打开转移舱后立即终止。因此，载物定位的设置已超时。
• “C脱气”处理旨在使C枪脱气，仅使用物质“脱气碳”编程。工艺设置为从 1.0 × 10^–4 mbar的压力开始，蒸发功率低至 30 W，靶向厚度为 0.0 nm，打开转移舱后立即终止。因此，载物定位的设置已超时。
• 采用以下设置设计了“Pt/C遮光”工艺：物质“未脱气铂”，靶功率100 W ，靶厚 2.0 nm ，真空度 < 2.5 × 10^–5 mbar ，工作台倾斜(相对于枪5°) - 54°，最大工作距离且旋转5 (最大)。
• 采用以下设置设计了“C覆盖”工艺：物质“未脱气碳”，靶功率 120 W，靶厚 6.0 nm ，真空度 < 2.5 × 10^–5 mbar，工作台倾斜(相对于水平方向) 20°，最大工作距离且旋转5 (最大)。

• 编写了由“脱气Pt/C”、“脱气C”、“Pt/C遮光”、 和“C覆盖”组成的序列。

实验前，彻底清洗Pt/C和C枪，按照说明书设置靶和丝。在真空室右侧端口上安装Pt/C枪，在左侧安装C枪。仪器采用LARS（低角度旋转遮光）载物台设置，石英晶体在侧位。

用（100 mmol/L乙酸铵, 30 %甘油, pH值7.6）喷雾缓冲液1∶20稀释130 µg/ml、长度为1,010碱基对(对应343 nm)的dsDNA 。使用 [1] 描述的喷涂装置将小液滴喷涂到新切开的尺寸约为2 × 2 mm的云母片上，用双面胶带固定在50 mm的圆形滤纸上。

喷洒完毕后，将滤纸上的样品迅速转移至准备好的徕卡 EM ACE600 上并抽真空。按照上述顺序执行，完成后自动通气。

从真空室中取出滤纸上的复型并将其转移到潮湿的由塑料盘、石蜡膜（防止样品受潮）和潮湿滤纸制成的小室中。为了便于复型的脱离，将其在 45 °C 的烘箱中培育 30 分钟。

随后，使复型漂浮在白色培养皿中的蒸馏水上，用无膜的400目Cu网捞取，然后转移到另一个装有ddH2O的培养皿中，以去除所有残留的有机物（甘油），再用另一个网捞取。用滤纸吸干镊子侧面和尖端的多余水分，将样品风干。

在80 kV的透射电子显微镜下观察风干的复型，可以通过在干燥液滴中心形成的残余盐晶体来定位感兴趣区域，如 [1] 所述。用CCD相机，按照0.373 nm/pixel的像素拍摄图像。

作者感谢维也纳格Gregor Mendel Institute, Vienna的Karel Riha团队提供样品，并感谢维也纳Campus Science Support Facilities GmbH的Electron Microscopy Facility (www.csf.ac.at/em)电子显微设施小组的协助。

1. Aebi U., and Baschong W: Glycerol Spraying/Low-Angle Rotary Metal Shadowing, in: Celis JE (ed.): Cell Biology – A Laboratory Handbook, third edition, 3: 241–46 (2006).