福斯特共振能量转移 (FRET)

荧光描述的是分子或原子在通过光的吸收激发电子系统后，自发发射光子的过程。发射的光子通常能量较低，因此波长较长（斯托克斯位移）。例如，蓝光激发可能导致绿色发射。如果第二个荧光分子能够吸收绿色光子，则该分子的发射再次发生斯托克斯位移，例如变为红色。这种再吸收在浓密样品中会导致测量误差（部分“内滤”效应）。在低浓度样品中，再吸收非常罕见。

如果两个分子在空间上非常接近（几纳米），能量可以直接从“供体”传递到“受体”，无需光的发生。这种能量直接交换称为“福斯特共振能量转移”（FRET）。“共振”表示两个分子必须共享能量窗口，即供体的发射光谱和受体的吸收光谱。尽管光子既不发射也不重新吸收，但能量传递仍然成立。FRET 的概率随着两个光谱的重叠面积增加而增加——窗口越匹配，传递的能量越多。此外，分子的取向也会影响转移效率。

对于上述示例，当样品被蓝光照射时，通常会收集到绿色发射。如果发生 FRET，还会发出红色光子，相应地减少绿色光子的数量。在极端情况下，所有能量完全转移，不会有绿色发射。FRET 效率由吸收的蓝色光子数量除以发出的红色光子数量定义，取值范围为 0 到 1。对于给定的 FRET 对，FRET 效率指示两个荧光物种之间的空间距离——这就是 FRET 测量的目标 [2]。

由于FRET需要荧光染料之间的距离非常短，因此它是验证细胞成分相互作用的工具。尽管通过测量纯粹的距离无法证明生物相互作用，但FRET将共定位精度提高到几纳米。二聚化过程和蛋白质的构象变化也是该方法的目标[3]。FRET生物传感器提供了一种间接应用，它们在与感知目标相互作用时改变其FRET效率。一个非常显著的例子是用于探测 Ca2+浓度变化的 Cameleon 生物传感器 [4]。

Förster 半径 R0 是一对荧光染料之间的距离，在这个距离下，FRET 效率达到 ½（即 50%）。通常，这个距离在 20 至 60 Å（2 至 6 nm）范围内。Förster 半径 R0 依赖于 FRET 对的光物理参数 [5]:

其中
kappa²: 定向因子
J(λ): 重叠积分
n: 折射率
Q_D: 供体量子产率

FRET 效率 E 取决于荧光染料之间的距离，表示为以下公式：

与
R₀: Förster 半径
r: 供体-受体距离

如果已知给定 FRET 对的 Förster 半径，测量的 FRET 效率即可揭示两个荧光染料之间的距离 r。由于效率与距离的依赖关系中涉及到 6 次方，因此测量非常关键。反过来，所有距离的计算都不应被夸大。然而，测量活体样本中 FRET 效率的变化可以揭示交互性、运输现象和其他细胞事件的直接指示。

在活细胞中，常用染料是 GFP 变体，而在固定样本中，使用的染料范围从抗体标记染料到 GFP 变体或两者的组合。图 2 显示了一些常用的 FRET 对。随着新染料和荧光蛋白数量的增加，这个领域变得越来越丰富。具有相似光谱特性的染料是可以互换的，所有类型的排列组合都是可能的。

测量 FRET 效应的最直接方法是 FRET-AP 方法。这里，样本被成像以显示供体。在之前的例子中，这指的是使用蓝色激发并收集绿色发射的实验。收集图像后，感兴趣区域被强烈照明，使用可以光漂白受体的光（因此称为“AP”，受体光漂白），但不会损坏供体。然后，拍摄供体的第二张图像。如果存在 FRET，供体在漂白区域的强度应增加，因为有更多的分子准备进行供体荧光，而不是流入 FRET 通道。FRET 效率 E 通过以下公式估算：

图 3：FRET 受体光漂白示例。左图为光漂白前的供体图像。

中间的图像显示的是在一小块矩形区域内受体光漂白后的同一区域。在该区域，由于所有激发的分子只能通过发射荧光光子来衰减，因此供体的发射增加了。周围区域较暗的荧光表示荧光 “泄漏 “到 FRET 通道中。

右侧的假彩色图像是根据 FRET 效率公式计算得出的。矩形区域的荧光强度较高，说明该区域在漂白前的 FRET 效率较高。背景不包含任何 FRET 效率信息。