显微镜中的荧光

荧光的一个重要特征是斯托克斯偏移。它描述了激发光子和发射光子的能级差异。荧光色素发出的光子比激发光子的波长更大。这是由于在荧光色素被激发后，但在其发射光子之前向周围释放了能量。由此产生的波长偏移可以区分激发光和发射光。能量的吸收和发射可视为分子物种的具体特征。

近年来，LED（发光二极管）也被用作荧光显微镜的光源。LED 发出的光的波长取决于生产所用的材料。不过，在大多数情况下都需要一个激发滤光器，因为 LED 发出的光波长范围通常相当宽。

大多数荧光显微镜都是外荧光显微镜。照明器和物镜位于试样的同一侧，光线不会穿过试样。除了激发和发射滤光片外，这种荧光显微镜还需要一个二向色镜。二向色镜允许特定波长的光通过，而其他波长的光则被反射。滤光片和二向色镜通常一起装在一个滤光片立方体中。

激发光穿过激发滤光片，然后照射到分色镜上。二色镜将光线通过物镜反射到试样上。试样中的荧光素被激发并发出光子。发射光通过物镜返回到二色镜。发射光具有适当的波长，可以通过。被试样反射的激发光无法通过二向色镜，会被阻挡。如果激发光能够通过二向色镜，则在到达发射滤光片时会被阻挡。通过发射滤光片的光可以用探测器进行测量。

荧光显微镜使用不同类型的滤光片。可以区分带通滤光片、长通滤光片和短通滤光片。带通滤光片可透过一个波长带，而波长较大或较小的光将被阻挡。长通滤光片和短通滤光片都是边缘滤光片。长通滤波器传输长波长的光。波长超过某一截止值的光将无法通过。相反，短通滤光片可以透过短波长的光，而阻挡长波长的光。

荧光显微镜应用广泛，特异性强。各种技术可以解决不同的问题，甚至可以避开恩斯特-阿贝（Ernst Abbe）所描述的衍射极限。

分子物种的定位可通过细胞器（如细胞骨架或细胞膜）的共同染色来确定。共焦激光扫描显微镜（CLSM）可以在没有焦平面外部信号的情况下观察样本区域，并可进行光学切片。全内反射（TIRF）显微镜是一种可以观察靠近细胞表面的薄区域的技术。蒸发场可激发该区域的荧光素。

光漂白后荧光恢复（FRAP）是一种观察分子物种动态的技术。限定区域内的荧光团被光漂白，未被光漂白的分子扩散到该区域的情况可以被测量出来。可以利用荧光能量转移（FRET）显微镜进行相互作用研究。激发的供体发色团可将能量转移到受体荧光色团并激发它。这只有当两者非常紧密地结合在一起时才有可能。如果这些染料耦合到不同的蛋白质上，那么只有当蛋白质相互作用时，它们才能传递能量并发出荧光。

亚分辨率成像技术包括受激发射损耗（STED）显微镜、地态损耗（GSD）显微镜、单分子和地态损耗显微镜（GSDIM）以及光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）。这些技术所使用的亚分辨率显微镜也被称为纳米显微镜，因为它们能分辨纳米尺度的图像。