超薄切片介绍

用于显微镜检查和阵列断层扫描(AT)的生物学试样及材料的超薄切片处理

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对样本开展研究时,为了以纳米级分辨率显示其精细结构,通常会使用到电子显微镜。电子显微镜有两种类型:扫描电子显微镜(SEM)用于对样本表面成像,以及需要使用极薄电子透明样本的透射电子显微镜(TEM)。因此,使用电子显微镜对样本内部的精细结构进行成像时,此类技术解决方案需要制作出非常薄的样本切片。被称为超显微技术的样本制备方法可以产生具有最小伪影的超薄切片(厚度20-150nm)。在切片过程中,样本的块面(切割切片处)始终保持在一个平直的表面上,可供SEM进行研究。当截面在阵列中成像时,就可以重建样本的三维图像。这种方法称为阵列断层扫描(AT)。超薄切片技术及其在AT中的应用概述如下。

Array Tomography

阵列断层扫描 (AT) 是一种用于细胞和蛋白质结构分析的高分辨率三维图像重建方法。该技术利用扫描电子显微镜(SEM)或光学显微镜(LM)中超薄、树脂包埋连续切片的有序阵列成像。AT技术能够对细胞及蛋白质结构开展定量立体结构分析和可视化观察。其横向和空间分辨率比传统的共焦显微镜更理想。此外,通过生物试样的部分自动化检测来实现更高的处理量。

超薄切片原理

利用阵列断层扫描进行TEM观察以及实现最优化3D重建时,超薄有序的切片是一大前提。超薄切片机(如徕卡显微系统的 EM UC7 )则可以制作出此类超薄的样本切片(厚度20 ~ 150 nm)。

要在透射电子显微镜中形成样本的图像,电子必须在不出现任何重大速度损失的情况下穿透样本。样本对电子辐射的渗透率部分取决于其质量和厚度(厚度×密度),部分取决于电子显微镜的加速电压。被样本吸收的电子会导致热量积聚,从而在物体中形成伪影。

應用圖片

Mouse heart. Courtesy of Riet De Rycke, University of Ghent, Belgium.

小鼠心脏。感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

Arabidopsis thaliana. Courtesy of Riet De Rycke, University of Ghent, Belgium.

拟南芥。感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

Arabidopsis thaliana. Courtesy of Riet De Rycke, University of Ghent, Belgium.

感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

Kidney, rat. Courtesy of L. Edelmann, University Hamburg, Germany.

大鼠肾脏。感谢德国汉堡大学L. Edelmann提供的图片。

Acidithiobacillus sp. HV2/2. Courtesy of Dr. Andreas Klingl, University of Marburg, Germany.

酸硫杆状菌 HV2/2。感谢马堡大学Dr. Andreas Klingl提供的图片。

Cross Section, Copper and Gold Layers – TEM image. Courtesy of WWU Münster, Germany.

铜与黄金层的横截面 – TEM图像。感谢德国WWU Münster提供的图片

Section surface, gold – AFM image.

黄金的切片表面– AFM图像

Image of the diamond knife of an advanced ultramicrotome solution for array tomography which performs automated serial sectioning
Image of the diamond knife of an advanced ultramicrotome solution for array tomography which performs automated serial sectioning. Wrinkle-free ribbons with uniform thickness are seen floating on the surface of water within the trough.

阵列断层扫描(ARTOS 3D)高级超薄切片解决方案的金刚石刀头图片,可用于执行自动连续切片。可见厚度均匀的无褶皱条带漂浮在水槽内的水面上。

阵列断层扫描的试样制备

为AT制备生物学软试样时需要完成若干步骤的操作。这些步骤包括:

  • 组织固定
  • 试样提取和树脂包埋
  • 连续切片和切片带收集,形成切片阵列
  • 视需要对切片进行染色以供成像。

然后通过SEM或LM(通常为荧光)对切片阵列成像。后续将阵列中的切片图像合并在一起进行3D图像重建和分析。

很多超薄切片机的AT样本制备涉及多个耗时繁琐的手动操作步骤。高级超薄切片机(如徕卡显微系统ARTOS 3D )超薄切片机则可通过试样切片的自动化处理来加速整个制备过程,最大限度缩短SEM或LM成像中的切片处理时间。有关超薄切片技术和阵列断层扫描的更多信息,敬请参阅以下所示的相关文章。

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Sep 22, 2014
教程

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超薄切片机和冷冻超薄切片机

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