落射荧光显微镜和反射对比显微镜

荧光既可以是生物和无机结构的自发荧光，也可以是用特殊染料（荧光染料、荧光标记）处理标本后产生的所谓二次荧光 [1-3]。要在显微镜中进行荧光成像，必须满足以下要求：强光源（LED 或气弧灯）、用于准确选择激发和发射光的适当透射滤光系统，以及适合的荧光成像的光学部件，即聚光镜、照明部件、分光镜、物镜、镜筒透镜、目镜和照相机 [4]。使用共聚焦显微镜系统可以进行多光子荧光显微镜观察，使用比发射光波长更长的 2 个或更多光子进行激发 [5]。

与今天相比，荧光显微镜的首次应用是在透射光和暗视野显微镜的基础上进行的，这是因为当时荧光显微镜的应用范围有限。但是，随着荧光显微镜在组织学、细胞学、分子生物学和免疫诊断等领域的应用日益重要，人们越来越需要从根本上改进照明和观察技术。这一需求催生了落射光显微镜或入射光荧光显微镜的诞生 [6]。

经过近 40 年的发展和改进，这项技术已成为生物学、医学、材料科学和工业领域常规和研究工作的基本工具之一。入射光荧光显微技术的进步主要得益于 Ploem 小组的研究工作及其引领潮流的作用，同时也得益于 Leitz（现为 Leica Microsystems）在开发所需光学仪器方面的前瞻性战略。

本文将介绍这一发展历程。

关于荧光显微镜的历史回顾，读者可参阅 Kasten [7]。Policard 和 Paillot [8]早已使用落射（垂直入射激发光）。Leitz （现为 Leica Microsystems）、Bausch & Lomb、Reichert 和 Zeiss 制造了一些仪器，这些仪器部分是根据 Ellinger 和 Hirt [9,10]、Singer [11]以及 Mehler 和 Pick[12,13]的建议制造的。Haitinger [14]描述了早期的徕兹荧光落射照明系统。关于落射荧光显微镜发展的更多细节，读者可参阅 Rost [15] ，关于入射光荧光显微镜的早期应用，可参阅 Hauser [16]。

Brumberg 和 Krylova [17] 对落射照明荧光显微镜的一大贡献是引入了二色分光镜（简称：二向色镜），用于紫外线（UV）入射照明。落射具有明显的光学优势。透射照明的聚光器和物镜具有独立的光轴，必须完全对准，而落射照明则不同，物镜既是聚光器，又是集光物镜，避免了所有对准问题。与透射荧光显微镜相比，使用二向色镜将荧光发射与激发光分离要容易得多。而研发人员缺乏兴趣的主要原因可能是透射光暗场紫外激发在大多数荧光显微镜应用中已经取得了极佳的效果 [18]。用紫外落射激发取代它不会带来明显的优势。直到 60 年代末，使用暗视野聚光器的透射光仍是行业标准。

然而，随着人们对分子生物学的兴趣迅速增长，许多用于检测细胞中重要大分子的 单克隆抗体 也应运而生。为了研究细胞器中几种大分子的详细形态位置，人们越来越多地使用不同颜色的荧光标记。传统上用于荧光显微镜的紫外线激发并不适合同时检测细胞中的多种荧光色素。

1962 年左右，Ploem 开始与肖特公司合作开发二向色光束发射器，用于反射蓝光和绿光，利用落射照明进行荧光显微镜观察。在 1965 年发表第一篇关于使用窄带蓝光和绿光进行落射照明的文章 [19]时，他还不知道 Brumberg 和 Krylova [20]开发出了用于入射光紫外激发的二向色镜。徕兹公司也不知道，他从该公司获得了一个带有中性分光镜的 "Opak "落射照明部件。他必须对这种照明部件进行改装，以便在入射光路径上安装一个滑块，滑块上有四个二向色镜，分别用于紫外线、紫光、蓝光和绿光的激发。这种装置由阿姆斯特丹大学开发，可以方便地在入射光路中更换不同的二向色镜（图 1a）。激发光的波长可以轻松快速地改变。

很快，人们发现使用窄波段蓝光和绿光激发为检测广泛使用的免疫荧光标记--异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）提供了最佳可能性。使用蓝光和绿光激发还能最大限度地减少组织成分的自发荧光，这是传统的紫外线透射照明达不到的效果。现在，FITC 可以使用窄带蓝光（使用半宽为 16 纳米的带干扰滤光片）激发，接近 490 纳米（长蓝波长）的激发最大值，并能清楚地观察到 520 纳米的绿色荧光发射峰。组织成分的自发荧光被降至最低（图 2a 和 b），从而获得高对比度。

将 FITC 激发至其激发最大值附近可实现高效激发，甚至可以使用在蓝色波长范围内没有强发射峰的汞灯。此外，使用绿色反射二色镜进行落射照明，还首次实现了用 546 纳米的强汞发射线激发 Feulgen-pararosaniline （图 3a 和 b）。

在描述带有四个二分束片的徕兹（Leitz）原型多波长落射照明部件的第二篇文章中（图1b），Ploem [20] 承认了Brumberg和Krylova [17]的贡献。由于当时俄罗斯的研究还处于起步阶段，而且俄罗斯或东德在落射荧光显微镜方面还没有任何重大的工业发展，因此徕兹公司早先并没有意识到这一发展。采用紫外光进行落射照明的可能性虽然在一些应用中非常有用，但并不是徕兹公司进行新技术开发的动机，因为他们已经有了出色的透射暗场紫外光激发技术。然而，随着全球范围内常规免疫荧光显微镜在医疗诊断和分子生物学研究中的应用日益广泛，使用蓝光和绿光窄带激发的新型落射照明技术也将从中受益标准的高压汞弧灯的使用让其成为了一个切实可行的提案。

随后，Leitz 开发出一种新型的多波长荧光落射照明部件（PLOEMOPAK），带有四个可旋转的二向色分光镜，分别用于紫外光、紫外光、蓝光和绿光 [22]。在连续几代徕兹照明部件（包含四个二向色镜）中，又增加了阻隔滤光器和用于激发片的旋转转塔。最后，卡夫（Kraft） [21] 设计了一种优雅的落射照明部件，包含多组激发滤光片、二色分光镜、阻挡滤光片或发射滤光片，安装在一个滤光片立方体或滤光片块中（图 4）。

由于这种照明部件可将滤光块快速转入光路，因此对同一组织切片进行多波长照明成为现实。此外，用户还可以更换照明部件中的四个滤光块（图 1c）。用户可以从许多滤光块中选择不同的四组滤光块进行组装，这些滤光块包含激发片、发射片和二向色镜的组合，是为不同应用而开发的。根据 Ploem 的建议，Leitz 还生产了一种带落射照明的倒置显微镜（图 5a 和 b）。有关用于多波长荧光显微镜的 PLOEMOPAK 照明部件的综述，请参阅 Pluta [23]的综述。

Leitz 滤光块系统非常高效，即使在今天，大多数显微镜制造商仍将类似类型的滤光块用于多波长荧光显微镜。这一发展最终促成了自动多波长荧光落射照明部件的开发，它可容纳八个滤光块，用于不同的波长范围（图 5c）。在滤光块之间切换时，由于采用了 0 像素位移技术，电脑显示器上的像素位移得以避免，或保持在 35 毫米胶片的分辨力以下。这种照明部件还可用于研究染色体的荧光原位杂交方法（FISH）。

Ploem [24,25,26,27,28], van der Ploeg 和 Ploem [29] 以及 Nairn 和 Ploem [30] 进一步探索了许多生物医学应用必须开发的滤光片组合。这是 Schott 和 Leitz 合作完成的。Rygaard 和 Olson [31] 开发了一种新型短波通高透射干扰滤光片，对蓝光具有极高的透射率，对波长长于 490 nm 的波长具有敏锐的过滤功能。

Ploem [32] 将这种短波通（SP）滤光片与肖特（Schott）公司生产的 1 毫米 Y（黄色）455 滤光片结合使用，后者可以阻挡紫外线的激发，并建议 Balzers 公司开发一种类似的滤光片（SP 560），用于绿光激发，另一种滤光片（长波通（LP）425）用于紫光激发。后一种滤光片被应用于神经递质的研究 [25]。在图 6a 和 b 中可以观察到由此产生的蓝色荧光。

在光学行业方面，Kraft [33], Walter [34,35], Trapp [36], 和 Herzog [37]等人撰写了有关这些发展的早期文章和评论。

用于落射荧光显微镜的滤光片主要分为两类：(a) 主激发滤光片 LP（长通）和 SP（短通）（在德国文献中称为 KP 滤光片）；(b) 次级滤光片，如屏障滤光片和发射滤光片[32]后者也被称为荧光选择滤光片，例如用于限制 FITC 在 520 纳米波长处的荧光峰值。Reichman [38]对荧光显微镜用滤光片进行了广泛的综述。

Cormane [39] 首次证明，在人类皮肤病的免疫荧光研究中，荧光标签 FITC 的窄带蓝光落射照射可产生最佳对比度。过去，用紫外线透射光激发皮肤中的弹性纤维会产生强烈的自发荧光，从而严重阻碍了荧光抗体的观察。

70 年代，随着免疫荧光和其他分子生物学方法（如 FISH）在医学诊断和研究中的应用在全球范围内不断增加，徕兹在落射照明荧光显微镜方面的开创性工作也应运而生。Hijmans 等人 [40,41] 率先证明了新型多波长激发外发光器的实用性，他们使用与绿色荧光染色剂 FITC 和红色荧光染色剂 TRITC 的抗体，选择性地检测细胞中某些类别的免疫球蛋白。他们采用蓝光和绿光双波长激发法，并通过 520 纳米的发射滤光片选择 FITC 的荧光峰值（图 7）。Brandtzaeg [42] 和 Klein 等人 [43] 在使用 Leitz 落射部件的双波长激发法鉴定免疫学上重要的细胞类型时也有类似的发现。在 "花环 "形成的血液染色中，使用紫外光和绿光的双波长激发法可以显示单核细胞周围的红细胞（图 8）。

在落射照明中，使用二向色镜将入射光偏转到样本上。二向色镜的光谱特性是这样设计的：只有所需的激发波长才能通过物镜向下偏转到样本上，而不需要的波长则会被二向色镜透射并收集到二向色镜后面的光阱中 [21] 。消除这些不需要的激发光可显著减少杂散光，从而提高图像对比度。二色镜可将所需的（短波长）激发光通过物镜偏转到样本上，但对较长的荧光波长是透明的。抑制滤光片（屏障滤光片）可吸收（或反射）从标本和物镜透镜表面反射的激发光，但对荧光高度透明，荧光随后可到达目镜或相机传感器。落射照明的效率与物镜数值孔径（NA）的四次方有关，物镜首先用作聚光器，然后作为聚光镜用于观察。在第一台多波长落射照明设备上市时，只有高 NA（0.95、1.30）的高倍率物镜（70x、100x）可供选择。根据 Ploem [19,20] 的建议，Leitz 成为第一家生产中等功率物镜的制造商，如 NA 为 1.30 的油浸 40x 物镜（图 9）。这种新型物镜专为落射照明荧光显微镜而设计，可产生非常明亮的图像，从而缩短了常规荧光显微摄影的曝光时间。

落射荧光显微镜的一个问题是如何以最佳方式使光源图像充满物镜的入口瞳孔。典型的光源中等放大倍率约为 8 倍。这一结果与各种高压汞灯和氙弧灯的电弧大小不同有关。此外，物镜的入口瞳孔也有很大差异，例如 100 倍、NA 0.90 的物镜入口瞳孔为 3.6 毫米，而 10 倍、NA 0.30 的物镜入口瞳孔为 12 毫米。此外，如果只有部分弧光能进入入口瞳孔，所获得的荧光强度就会减弱。Schönenborn [44] 报告了 DM R（HCS）显微镜中创新的入射光的路径。现在，落射光路的设计允许根据不同应用的特定光源对光路径进行单独调整。假定在入射光光路中使用科勒照明，则需要将照明光学部件和聚光镜组合起来，以便在物镜的入射孔中对光源成像。对于特定物镜，光源放大倍率的选择直接取决于其几何尺寸。卤素灯的调节应该非常精确，因为灯丝的线圈对于灯丝调整的不准确非常敏感。。因此建议使用相对较低的放大倍率。

徕卡显微系统公司进一步改进了荧光显微镜的物镜。选择自发荧光特性低的光学玻璃可提高图像对比度。

宽场照明荧光显微镜的一个问题是，相对较厚的标本无法获得清晰的图像。造成这种结果的原因是，在使用高数值孔径物镜时，相邻光学平面的散射光会对最终显微镜图像造成不必要的失焦。不过，徕卡共聚焦显微镜可以利用光片技术，从样本内的一个或多个焦平面获得高横向和纵向分辨率的清晰图像。

光谱拆分进一步提高了样本中多种荧光染料的颜色分离效果。在生物医学和材料研究领域，计算机辅助光谱共聚焦扫描显微镜已成为荧光显微镜的强大工具。最近，一种名为 Mica 的成像系统问世。它统一了多种荧光成像模式，包括宽场、共焦、Thunder、LIGHTNING、多重标记等。

用于分子生物学各种应用的滤光块

在过去的十年中，分子生物学的应用急剧增加，因此开发出了许多适用于各种应用的滤光片组合，其被安装在各种滤光块支架中。荧光落射照明可通过手动或电动方式切换2 至 8 个滤光块。在此不对各种滤光快的多种应用进行全面详细的讨论。

反射-对比显微镜 (RCM)

徕兹公司开发的落射光显微镜还带来了进一步的发展：反射-对比显微镜（RCM） [45,46]。反射-对比显微镜可从过氧化物酶-DAB、免疫金银和免疫磷酸酶等常规标记物染色的标本中获得强信号（图 10 和 11）。由于强信号增强了图像对比度，且图像质量不会因前后焦点的偏移而变差， RCM 可以用来观察超薄的样品并可获得高清的图像。

电子显微镜（EM）中使用的大多数免疫染色物质的强反射提供了如此高对比度，以至于这种染色可以与许多经典的（吸收性的）组织化学染色物质结合在一起，用于显示适度强反射的重要大分子。后者的染色通常用于增强细微的形态定位，并且在许多情况下，比仅使用荧光标记物更精确地确定了免疫标记物的位置。此外，这样的光学显微镜观察结果可以通过使用具有相同免疫染色的下一个超薄切片进行电子显微镜检查来进行确认。

通过共聚焦激光扫描显微技术，可以在不需要特殊物镜或其他减少杂散光光学措施的情况下执行反射式对比显微（RCM），得益于通过小孔照明消除杂散光的效果。大多数具有吸收特性的免疫染色剂对激光有着非常强的反射作用，并且其褪色现象极为有限。这些染色剂常允许采用更小的小孔尺寸（例如，10微米），此尺寸比在共聚焦荧光激光扫描显微中使用的大多数荧光染料所能接受的小孔尺寸小（为其五分之一到十分之一）。因此，反射型免疫标记的使用可显著提高光学分辨率。使用荧光染料双重染色并通过Leica共聚焦激光扫描显微镜成像的样本，提供了同时检测多个标记物和一个反射型免疫标记物的可能性。

RCM 使用荧光显微镜架、落射照明部件和高强度光源（如气体弧光灯）。在荧光落射照明部件中，必须插入一个额外的偏振滤光块，其包含偏振片、反射器和分析器（图 12）。此外，还必须将反射对比（RC）光阑模块（包含中央光阑系统）置于入射光路径中。该RC光阑模块适配具有中央光阑和/或孔径光阑的滑动组。此外，应该将专门为反射对比显微镜开发的特殊目镜添加到显微镜目镜套装中。

反射光显微镜的对比度基于反射强度（反射率）的差异。对于这种显微镜，光的反射发生在每一个光学边界，即当折射率和/或吸收率发生变化时。对于反射率小于 1%（大部分小于 0.2%）的生物标本，由于显微镜管内存在不必要的反射，因此使用传统显微镜几乎不可能获得反射光图像。 第一种方法是在入射光路径上与物镜后焦平面（孔径）相接的平面上插入中心挡片（带有中心挡片的光圈光阑，形成环形孔径），使入射光成为环形光锥。第二种方法是使用 "防反射 "方法减少不必要的散射光或反射光。通过使用交叉偏振片来抑制显微镜内部的反射光，从而使只有从标本反射的光才能传递到目镜或相机传感器。因此，物镜的前透镜上装有四分之一波板。光线通过四分之一波板时（向下到达样本，从样本反射后向上），光线的偏振方向会改变为 2 x 45° = 90°。