共聚焦成像和光片成像

通常，当我们提到光学切片时，首先想到的是共聚焦显微镜 [1] 。共聚焦原理已经无缝地集成到标准型光学显微镜中（尽管技术整合需要进行大量的修改）。与普通光学显微镜不同，真正的共聚焦成像要求照亮尽可能小的单点。光斑的直径由波动光学决定，并在 d ≈ λ/NA 时达到衍射极限最小值。详细的强度分布由点扩散函数描述。同时，探测器也必须感知尽可能小的光斑。由于光路是对称的，同样的数学原理也适用于点状探测器的传感分布。通过在检测路径中的中间像面引入针孔光圈来实现点探测器。在样本中，照明和检测的焦点必须重合——因此称为“共聚焦”显微镜。如图1所示，针孔的效果是光学地去除所有不是来自焦平面的光线。它的功能是在z方向上作为空间滤波器。

由于光学刀片一次仅在一个单点上工作，为了生成图像，这个点必须从上到下逐行移动。强度同步转换为数字信息，并存储在计算机的帧存储器中。从这种电子存储器中，图像在普通监视器上显示。由于图像必须逐点顺序构建，因此只有在影响帧格式和接受的信噪比的一定限制下，才能实现高帧率。例如Leica SP探测器和混合探测器（HyDs）等高度透明的光束路径以及非常高效的传感器有助于提高高帧率性能。与PAL标准显示的线频率约为15,000 Hz相比，共聚焦显微镜实现了高达 12,000 Hz 的线频率。在适当的条件下，每秒的帧率可能高达约500帧。尽管如此，为了获得信噪比足够高的图像，帧率通常不会超过每秒 10 帧。

与扫描过程相关的另一个问题是，样品中焦点平面以上和以下的区域会暴露于大量照明能量，这些能量不会贡献于图像，但可能会导致荧光染料的光物理降解。由于荧光染料在焦点平面以上也会吸收光，因此当深入样品聚焦时，荧光强度会变得越来越暗。这可以通过自动增益适应来补偿，但会降低信噪比。

真正共聚焦成像的积极方面在于其高分辨率（易于应用高数值孔径镜头）、焦点平面上的图像本身均匀，以及共聚焦显微镜可以轻松分析标准制备。共聚焦显微镜基于标准同轴光学显微镜，通过简单的切换，显微学家可以使用所有标准的显微镜方法和对比度模式。它也是其他类型扫描显微镜的基础，如多光子激发、高次谐波产生显微术、相干反斯托克斯拉曼散射显微术和超分辨率技术STED（受激发射损耗显微术）。

尽管共聚焦显微镜是光学切片技术的黄金标准，但执行这一任务的第一台显微镜早在半个世纪前就已经问世。这款“Spalt-Ultramikroskop” [2] 使用了一个明亮的光源（弧光灯或太阳），该光源聚焦到一个狭缝孔径中。第二个透镜，通常是一个再利用的物镜，将这个狭缝正交投影到显微镜的光轴上的样本中。这种设计有效地创建了一个厚度约为两微米的片状光。早期的应用是关注亚分辨率粒子，如彩色玻璃中的分散金。后来证明它对化学和医学研究中常见的各种胶体样品和混浊介质非常有用。这种早期的光片显微镜仅限于可视化小到5纳米的粒子，这些粒子会引起照明的球形散射，这种散射在显微镜的垂直光束路径中作为衍射图案被观察到。因此，它可视化的是称为“Ultramikronen”的不可解析粒子，即“超出显微镜分辨率”的粒子。尽管“超显微镜”这个名字首先会让人联想到一种超分辨率类型的设计，但作者明确表示，超显微镜明显受到光学衍射的限制。

后来，人们开发了避开精密狭缝的设计，并使用了筒镜来创建垂直于光轴的片状光 [3]。这种布置随后被用于荧光固定样本。光片显微镜特别有利于对厚样本进行快速活细胞成像，因为漂白现象不太明显，而且图像记录是由数字相机并行进行的，如Huisken所示 [6]。由于照明在z方向上聚焦的所有位置都是相等的，因此z方向上的吸收不是问题。然而，发射光必须通过样本，就像普通显微镜一样，这可能会在一定程度上使厚样本的图像质量变差。尽管如此，在侧向方向上仍然存在阴影效应：光首先被照明光进入样本的一侧吸收，因此，荧光在相反的一侧会变暗。Voie [3] 通过旋转样本并从不同方向收集图像来补偿这种效应。Dodt [7] 从两个相对的方向照射样本，以补偿光片的光吸收。Keller [4] 没有使用投射的狭缝孔径或圆柱形透镜，而是扫描了垂直于观察轴的细激光束。这种方案被称为“数字扫描光片”。

这两种范例都已被引入生物医学研究和常规流程中，为生物概念和疾病以及细胞成分的构造和功能提供了新的见解和理解。在仪器方面，这两种方法存在显著差异，正交照明被视为系统的独立部分，并与同轴显微镜结合以执行任务。共聚焦显微镜使用光束扫描系统创建二维图像，而数字扫描光片使用光束扫描从线条创建区域。这立即引发了一个问题，即是否有可能将这两种策略结合到单个系统中。徕卡显微系统（Leica Microsystems）使用STELLARIS DLS光片显微镜 [5]提供了这种解决方案。

STELLARIS DLS基于普通共聚焦显微镜，这是一种同轴扫描设备，它通过检测针孔在空间上过滤失焦光来进行光学切片。通过电流计扫描镜使照明光斑在两个侧向方向上移动来生成图像。要将这样的系统转换为数字光片显微镜，必须使照明光束通过样本，垂直于光轴。通过在观察场外的焦平面位置引入一个小镜子，可以实现所需的正交照明。这种偏转镜与观察镜机械连接，以确保照明的z位置始终位于图像生成光学的焦点上，同时图像被投射到检测器上，将强度转换为数字图像。

照明光束的单个位置不会形成二维图像，而只会形成一条线。可以利用共聚焦显微镜中固有的一个侧向扫描模式来在垂直方向上扫描照明线，从而得到所需的二维平面。

如果在相反的一侧引入第二个镜子，就可以通过同一透镜从两侧照射样本——仅通过使用共聚焦显微镜的光束扫描设备的第二个轴。这满足了补偿因吸收导致的阴影的需要。之后的图像随后再由两个不同照明方向的图像重新构建。

在共聚焦模式下进行成像时，必须调整z轴驱动元件，使照明光束的焦点与要成像的特征重合。然后，扫描过程仅覆盖视场内部，有效抑制了焦外光，从而获得高对比度的图像。切换到光片采集模式时，需要将焦点移动约等于镜面到光轴的距离。此时，光束的平面生成部分将落在观察视场的中心。扫描装置需要指向视场边缘，才能照射到镜面并生成光片。

这种组合不仅降低了仪器成本，因为两个不同的仪器合并为一个，而且它还允许将经典共聚焦显微镜和光片显微镜结合起来。因此，同一系统允许使用适合解决当前研究问题的技术来探索任何样本。它还为各种新的应用机会提供了可能，因为共聚焦路径可用于光操控，随后通过温和的光片成像观察诱导效应。

1. Minsky M: Microscopy Apparatus. US Patent 3.013.467, filed 7^th November 1957, granted 19^th December 1961 (1961).
2. Siedentopf H, and Zsigmondy R: Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikroskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Ann. Phys. IV (10): 1–39 (1903).
3. Voie AH, Burns DH, and Spelman FA: Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microscopy 170 (3): 220–36 (1993).
4. Keller PJ et al.: Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science 322: 1065 (2008).
5. Knebel W, and Sieckmann F: Verfahren und Anordnung zur Beleuchtung einer Probe. German patent application, publication Nr. DE 10 2011 054 914 A1 (2011).
6. Huisken J et al.: Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 305 (5686): 1007–9 (2004).
7. Dodt HU et al.: Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods 4 (4): 331–36 (2007).