CARS 相干反斯托克斯拉曼散射显微镜： 分子特征振动对比成像

分子中的化学键可以振动、弯曲和颤动。这些运动以特定的速率或频率进行，这些频率非常独特，我们可以通过调节到这些特定的振动频率来识别化学键的类型。例如，许多有机分子包含碳和氢原子之间的键，因此它们具有 C-H 振动。更重要的是，C-H 振动频率与其他化学键（如 O-H 键）的振动频率非常不同。换句话说，通过检查分子的振动频率，我们可以对分子的化学结构做出有意义的判断。因此，振动分析相当于化学分析。

这些振动运动中的一部分可以通过光照射分子来探测。不幸的是，分子振动的频率远低于可见光的振荡频率。这意味着我们无法直接使用普通光源（包括光学显微镜中的激光）来探测这些分子运动。但是，我们可以采用间接的方法来探测分子。拉曼光谱学就是这样一种间接探测的方法。在拉曼光谱学和显微学中，常规激光束照射样品，并分析从分子上散射的光。与激发光颜色不同的散射光可能包含有关分子振动的信息。这种方法看起来与荧光测量非常相似，但收集到的信息却大不相同。在拉曼光谱学中，激光光频率与拉曼散射光频率之差对应于化学键的频率。通过使用适当的滤波器和光谱仪，可以在光学显微镜中收集拉曼散射光，从而收集有关样品的化学信息。由于几乎每个分子都表现出特定的拉曼活性化学键振动，因此可以生成样品的化学图谱，而无需任何外在标签。这种能力已经引起了包括材料合成、法医学、矿物学、毒理学和艺术品化学分析在内的许多研究领域的兴趣 [2]。

拉曼光谱学和显微学也对生物学产生了影响。拉曼显微学能够以无标记的方式研究细胞和组织，这为研究难以染色或准备进行标准光学检查的生物样品提供了机会。例如，拉曼光谱学已显示出足够的灵敏度，能够检测出健康组织和癌组织在化学成分上的细微差异。尽管拉曼显微学在生物学研究中具有巨大的潜力，但它尚未在生物学实验室中完全成熟为一种常规成像技术。拉曼显微学在组织和细胞研究中的影响力有限的原因是拉曼信号本身较弱。信号微弱是因为拉曼效应间接探测分子：激光不与分子振动共振。拉曼效应是可测量的，但与荧光相比，它是一个非常微弱的现象。这意味着记录拉曼图像比记录荧光图像要花费更长的时间。虽然大多数荧光图像可以在一秒钟内拍摄完成，但相同尺寸的拉曼图像可能需要一个小时或更长时间。显然，这样的图像采集时间对于生物成像应用来说并不具有吸引力。

这是否意味着拉曼显微技术在快速生物成像领域没有前途？幸运的是，还有其他拉曼技术可以显著提高信号水平。非线性拉曼技术利用超快脉冲激光，以更高效的方式探测分子的振动响应。从物理学的角度来看，非线性拉曼技术使分子以统一的方式振动，产生的相干信号可比传统拉曼光谱高出五个数量级。存在多种非线性拉曼技术，如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），它们都探测相同的拉曼活性分子振动 [3]。这些技术并非新技术：非线性拉曼方法的大部分基础工作早在 20 世纪 60 年代就已奠定。在非线性拉曼方法家族中，CARS 是第一个发展成为用户友好型显微镜工具的方法。第一台 CARS 显微镜可追溯到 1982 年，但首次实用的生物应用是在十多年前，即 1999 年展示的 [4]。从那时起，CARS 显微镜技术已经发展成为一种易于使用的成像工具，徕卡 TCS CARS 显微镜的推出更是为其增添了实时振动对比度，为光学显微镜的成像领域增添了新的色彩。CARS成像模式提供的图像既快速又清晰，其效果可与共聚焦荧光显微镜相媲美。凭借这种成像能力，全新的成像应用领域触手可及。

CARS显微镜的应用范围是什么？CARS显微镜在脂质成像领域已经产生了重大影响 [5]。通过调节到脂肪族分子的对称 CH2 伸缩振动，可以可视化脂质。例如，CARS显微镜可以区分饱和脂质和不饱和脂质，可以选择性地检测胆固醇和胆固醇酯，并且可以揭示脂质膜堆积密度的信息。CARS显微镜足够灵敏，可以捕捉到来自单个磷脂膜的信号，从而能够研究膜生物物理学、囊泡运输和细胞器定位。来自脂质的强CARS信号也促进了脂质代谢、细胞内脂质体转运以及脂质积累与肿瘤生长之间相关性研究的开展。最重要的是，来自富含脂质的髓鞘的强CARS信号揭示了神经退行性疾病进展和治疗方面的一些重要见解。

另一个令人感兴趣的振动响应是蛋白质的振动响应。虽然CARS显微镜无法对蛋白质进行最终区分，但有可能生成蛋白质密度的图谱 [6]。CH₃ 甲基伸缩振动为组织和细胞中蛋白质分布的绘制提供了方便的手段。蛋白质密度的空间分布通常是病变组织中的一个重要标志物。

CARS显微镜也被用作监测生物和合成系统中水动力学的首选方法 [7]。O-H 伸缩振动为组织中的水提供了一个敏感的探针。这使得除了研究设计微结构材料中的水动力学之外，还可以研究单个细胞和细胞器中的水分渗透。

CARS 显微镜具有无标记和无创特性，因此非常适合用于监测外用化学品在体内通过皮肤的渗透情况。CARS 已被用于跟踪矿物油在动物模型皮肤中的扩散情况 [8]；这种方法最近也被证明适用于人类患者的皮肤 [9]。

除了对组织和细胞进行无标记的化学成像外，CARS显微镜还被用于观察聚合物薄膜和人造微结构的化学成分。对比度可以来源于聚合物中碳网络的振动运动，也可以来源于有机分子的羰基。许多聚合物结构发出的 CARS 信号都很强，可以调节到多种用于成像的振动拉曼特征。此外，CARS显微镜可以探测具有强吸收特性的分子系统。例如，可以在CARS显微镜下单独可视化碳纳米管。同样，基于其非线性CARS响应，也可以逐一可视化半导体纳米颗粒，如硅和氧化铁纳米结构 [10]。重要的是，这些纳米颗粒的CARS信号不会发生光漂白，从而保证了样品对比度的持续成像而不褪色。这些例子说明，CARS显微镜在材料科学中有着广泛的成像应用。

与荧光显微镜相比，非线性拉曼显微镜相对较新。然而，非线性拉曼技术的影响已经显而易见，特别是在生物组织的无标记成像领域。非线性拉曼技术并非与荧光技术竞争，而是基于振动对比快速生成图像的能力为光学显微镜现有的对比机制增添了新的维度。CARS成像模式的商业化，为显微镜学家提供了更多选择来检查照明样本的微观细节。随着新的对比度的出现，也带来了新的发现。看到像CARS显微镜这样的技术如何扩展我们对微观世界的理解，真是令人兴奋。

1. Krishnan KS and Raman CV: A new type of secondary radiation. Nature 121 (1928) 501–502.
2. Turrell G and Corset J (eds): Raman Microscopy. Developments and Applications. Academic Press, San Diego (1996).
3. Min W, Freudiger CW, Lu S and Xie XS: Coherent nonlinear optical microscopy: Beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62 (2011) 507–530.
4. Zumbusch A, Holtom G and Xie XS: Vibrational Microscopy Using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (1999) 4142–4145.
5. Le TT, Yue S and Cheng JX: Shedding new light on lipid biology with coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. J. Lipid Res. 51 (2010) 3091–3102.
6. Benalcazar WA and Boppart SA: Nonlinear interferometric vibrational imaging for fas label-free visualization of molecular domains in skin. Anal. Bioanal. Chem. 400 (2011) 2817–2825.
7. Potma EO, d Boeij WP, v Haastert PJM and Wiersma DA: Real-time vizualization of intracellular hydrodynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 1577–1582.
8. Evans CL, Potma EO, Puoris'haag M, Cote D, Lin C and Xie XS: Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 16807–16812.
9. Breunig HG, Bückle R, Kellner-Höfer M, Weinigel M, Lademann J, Sterry W and König K: Combined in vivo multiphoton and CARS imaging of healthy and disease-affected human skin. Microsc. Res. Techn., DOI: 10.1002/jemt.21082 (2011).
10. Wang Y, Lin CY, Nikolaenko A, Raghunathan V and Potma EO: Four-wave mixing microscopy of nanostructures. Adv. Opt. Photon. 3 (2011) 1–52.