结合 STED 和Lifetime的优势

Alberto Diaspro是热那亚大学物理系的应用物理教授，并且是意大利技术研究院纳米显微镜研究领域的主要研究员。Diaspro教授创立了LAMBS（高级显微镜、生物成像和光谱学实验室），并发表了超过400篇国际学术论文。他是多光子显微镜、远场光学纳米显微镜、三维成像、荧光、无标记以及光学超分辨率显微镜技术的专家。

感谢您今天接受我们的采访。能否多告诉我们一些您选择购买 STELLARIS 8 共聚焦系统的原因？

我最关注的一个特性是白光激光器。其次是STELLARIS系统处理荧光寿命数据的能力。这两个方面对我们来说非常重要，因为我们在实验室中已经长期应用寿命数据和相位分析。

当您提到相位分析时，您是指您 STELLARIS 8 系统的 TauSTED 功能...

是的，我认为 TauSTED 是实现 STED 技术的一大进步。它不仅鼓励人们使用 STED 技术，还促使他们利用单光子计数的优势。

如何实现呢？

生物实验的出发点是问“我想看到什么？”然后是“我需要什么级别的分辨率来看到它？”假设我知道我需要的分辨率低于衍射极限。那么在实验室里拥有一种能够使用两种激光和一个旋钮来选择特殊分辨率的系统来回答我的生物学问题，并使用第二种激光和旋钮实时改善空间分辨率，这有多令人兴奋？

TauSTED意味着在非常高的分辨率下拥有非常稳健的图像，因为你有额外的数据，荧光寿命信息，你正在以巧妙的方式使用这些信息来重建图像。20世纪40年代有一位非常著名的科学家说我们不会克服衍射极限。衍射就在那里，我们只是添加信息——当我们重建图像时，我们可以得到更多的细节。我们现在可以用TauSTED做的是，以智能的方式添加信息，利用额外的信息来改善图像重建。这对于共聚焦成像、多光子、STED或任何其他对比机制都是有效的。

这让我们回到您为什么会被带有白光激光器的系统所吸引。

是的。我们选择 STELLARIS 是因为白光激光器（WLL）是一种闭合光谱圈的方式——借助 AOBS，您能够使用大量光子进行光谱检测物种。您有非常重要的一点：尊重光子，不丢失光子，以最佳方式使用所有到达的光子。而且通过白光激光，我可以在激发光谱周围的区域内调节激发。使用 WLL，我还可以在光漂白方面进行优化。当我们处理荧光分子时，并非总是在激发光谱的最大值激发效果最佳。在某些情况下，如果您可以在其他区域工作，在回答生物学问题和需要减少光漂白时，这是一个非常大的优势。

简而言之，对我们来说拥有 WLL 的主要好处不是可以同时成像 8 个荧光信号。这很棒，但对我们来说，最大的好处是我在激发和检测方面有调节的自由。这作为照明的时间调制非常重要。

在培训用户时，拥有 WLL 的另一个重要方面就体现出来了。在培训新一代显微镜专家时，您需要这样的系统，因为您可以自由选择激发的波长并在光谱检测范围内进行调节。这具有巨大的价值，因为它有助于他们真正开始理解荧光的情况。

STELLARIS 还有其他方面对您的工作有益吗？

还有一个方面我觉得很有吸引力：新的探测器系列。当你拥有能够进行单光子计数的探测器，并且你需要它们来处理寿命问题时，这就意味着在饱和度方面不再有问题。这对生命科学研究非常重要，对我在材料科学方面的项目也是如此。

总的来说，这是共聚焦技术的一个真正的巨大飞跃。分辨率佳。通过使用荧光面板向系统发出指令的方式，确实有助于了解自己在做什么。光学切片也非常好。当你需要一定的空间分辨率时，取样的方式也很好。这些天，我对我遇到的所有人说，这是我职业生涯中使用过的最好的商用共聚焦系统。

但对我来说，最好的是你们显示与寿命有关的数据的方式。长期以来，我们一直使用相位法来浏览荧光图像并了解发生了什么。当你在超分辨率下进行此项工作时，这是一个很大的优势。

您的系统如何帮助您进行实验？

可对激发进行调整，有助于为样品添加最佳制备。您可以同时进行光谱分析和显微分析。用户可以真正优化使用该系统收集的数据种类。然后再切换到 STED，这真是太棒了。STED 并不意味着只具有超分辨率，而是意味着可以通过旋转旋钮，自由浏览到您感兴趣的特殊分辨率，直到找到您想看的东西。这非常令人兴奋。我必须承认，当您使用STELLARIS 8工作时，您很难离开实验室。你会开始探索该系统的所有潜力，而不会意识到时间的流逝！

在培训时，STELLARIS 与其他共聚焦显微镜有什么区别？

他们可以开始思考在特定波长激发的意义。在开始采集一系列图像（例如30或50张幻灯片）之前，他们可以先进行光谱分析。如果一开始，他们有机会通过调整激发波长和光谱窗口来了解发生了什么，而不是仅仅开始采集数据，那么他们的实验结果将会更优化。这让他们理解激发荧光分子意味着什么。首先，他们会遵循系统在设置中选择荧光团时给出的建议。但是，能够操纵激发和检测光谱，在不同波长之间滑动，可以让他们亲身体验信息，而不是简单地信任它。一个很好的例子是：许多研究人员认为激发荧光素的最佳波长是488纳米，因为在其他使用单线激光器的系统中，这是他们能使用的最佳波长。但如果你能调节波长，跟踪真实的激发光谱，你就能看到这个光谱在样品条件下会发生变化，这样你就能真正看到激发和发射的肩峰。当你进行调节时，能够去除不需要的信号。这不仅对培训有好处，对实验结果也有益！

有没有特定的应用场景特别适合使用STELLARIS 8？

当你处理一个固定的样本时，不是说一切都能很好地运作，但大致上都能正常工作。然而，当你处理一个活体样本时，你可能需要改变当前的条件，以便更好地观察发生了什么。然后，我们有你操作时的定量信息，比如功率，激发体积……你拥有所有这些数据，再加上可调性。这就是你能够在你面前优化活细胞成像的能力。

研究人员使用配备TauSense工具的STELLARIS系统的体验如何是怎样的？

这有点像是发现了一个新世界。最初，理解如何处理这些数据可能看起来有点令人畏惧。获取寿命信息意味着什么？但当他们开始使用它时，他们意识到这确实是一种额外的价值，能够利用寿命信息来区分不同的荧光物种，并更深入地理解自荧光现象。

对于那些认为白光激光器（WLL）并不适合他们的人，你会怎么说？

使用白光激光，您可以更好地控制您的实验，但您需要对您要进行的实验有更多的了解。您要在实验中加入光谱学，您需要决定将激发光谱置于何处，以优化您的试样。对于不太熟悉显微镜的研究人员来说，这可能令人害怕，但它能帮助他们了解如何以最佳方式优化实验，从而避免光漂白等现象，真正从样本中获得最佳信号。进行科学研究，而不仅仅是成像。

这种 WLL 很容易调整。对我们来说，最大的愿望就是能利用 WLL 获得寿命数据，现在我们已经做到了。我们还想进行 FRET 实验，因为 WLL 非常适合这种实验。您可以以任何方式进行 FRET：光谱偏移、寿命，而且不会因为受限于固定波长而对受体或供体造成不必要的光漂白。现在，您可以选择最佳波长，而不会破坏实验。

如今，我认为这是我在实验室里用过的最好的显微镜。

Alberto Diaspro教授

关于向近红外区域的红光扩展呢？

是的，我们有研究人员对此感兴趣。主要是因为标记效率和实验持续时间的考量。当你向红外光谱区域移动时，你可以进行更长时间的实验，特别是那些对胚胎和斑马鱼、厚的活体样本感兴趣的研究人员，肯定能从红光扩展中获益。如果你需要进行深层成像，向红光区域发展总是最佳选择。

在我们结束访谈之前，您还有什么想要分享的吗？

让我告诉你，我们从Leica Microsystems团队那里得到了很好的技术支持。无论何时我们联系，总能在极短的时间内得到答复——理解问题所在并提供解决方案，迅速解决问题。这对我们来说非常重要，因为我们的系统总是被预约得满满的。对我来说，Leica Microsystems的技术服务是意大利一流的。当你在自己的实验室中获得商业系统，用于个人研究并在机构设施中共享时，优质的服务确实能带来巨大的差异。