CARS 相干反斯托克斯拉曼散射显微镜简介

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）的首次记录可以追溯到上个世纪60年代，当时福特汽车公司科学实验室的两名研究人员P. D. Maker和R. W. Terhune发表了一篇关于他们实验的文章。他们简单地将这项工作称为“三波混频实验” [1]。大约十年后，70年代中期，斯坦福大学的R.F. Begley、A.B. Harvey和R. L. Byer展示了CARS相对于拉曼光谱学的优势，并首次将其应用于生物样品上 [2]。自此以后，CARS的发展势不可挡。1999年，A. Zumbusch、G. R. Holton和Xie, X. S. 发表了关于“使用相干反斯托克斯拉曼散射的振动显微镜”的文章 [3]，而在2004年Potma和Xie发表“CARS在生物学和医学中的应用” [4]之后，相干反斯托克斯拉曼散射技术正式进入生命科学领域。

与此同时，关于CARS的出版物数量从2004年的仅20篇增加到去年的75篇以上，其中包括越来越多具有生物学和医学背景的应用。

CARS（相干反斯托克斯拉曼散射）是一个三阶非线性过程，涉及频率为ωp的泵浦光和频率为ωs的斯托克斯光。在相位匹配方向上产生频率为ωas= 2ωp- ωs的反斯托克斯光信号。样品通过波混合过程被激发。当泵浦光和斯托克斯光之间的频率差Δω=ωp- ωs等于特定化学键的分子振动频率时，就会产生CARS的振动对比度，并且该化学键的分子振动会相干地受到驱动。

CARS信号是由样品中分子的振动运动产生的。获取CARS图像不需要外部标记物。不同类型的分子表现出特有的振动能量状态。适当波长（红外线）的电磁能量会将这些分子激发到这些能态。为了产生高于噪声的足够信号，CARS概念首先通过从基态泵浦到虚拟态来填充特征的振动态。这是通过用中等波长（ωP）的“泵浦”光束照射来实现的。光子的能量必须小于从基态到第一激发态的差值。在同时用较长波长（ωS）的第二束光（斯托克斯光束）照射时，分子被迫从虚拟态进入所需的振动态。由于泵浦光束是可调的，因此可以特别地将剩余差值ωΔ = ωP-ωS调整为相关分子的所需振动能量。本质上，将所需分子群体转换为振动态。为了可视化分子，泵浦光束将电子系统提升到能量的第二虚拟态ωP+ωΔ。从这里开始，分子被允许弛豫回到基态，同时检测到能量ωP+ωΔ = ωAS（反斯托克斯光束）。这些光子用于成像。

CARS信号可以在两个不同的方向上检测：

1. 前向CARS（F-CARS），使用透射光检测器检测

通过精确定义的滤波器组，在相位匹配方向上检测信号。F-CARS信号通常非常强，可以与非共振背景（由周围溶剂产生）明显区分开来。前向CARS适用于薄样品。

2. 反向CARS（E-CARS）

如果较弱的F-CARS信号被非共振背景所掩盖，则可以通过反向检测来增强对比度，从而降低图像的噪声。E-CARS对小于光波长的聚焦物体特别敏感。当样品散射性很强时，前向传播的CARS信号会发生反向散射，从而产生强烈的后向信号。

共聚焦和多光子成像技术可以可视化生物样品中的典型结构或动态过程，但这取决于样本中现有的自发荧光物质或合适的荧光染料。因此，需要新的染料来分析生物样品中未知且可能相关的细节。

对标准荧光样本进行染色通常既费时又费钱，并且可能以化学方式影响活细胞的典型特性。因为它们是以化学方式作用的。此外，染料会失去强度并改变样本。它们通常会引起光毒性，对样本造成伤害，从而可能影响实验结果。

CARS通过其固有的方法特性克服了这些缺点。CARS不需要标记，因为它对基于振动对比和化学选择性的分子化合物具有高度特异性 [1-5]。该方法的关键优势在于样品几乎不受影响。

有了CARS，以前由于没有合适的染料而无法染色的新样品现在也可以染色了。

通过将CARS技术集成到共聚焦系统中，可以克服传统显微镜技术的缺点。最新的商业开发成果是一种易于使用且高效的成像显微镜，适用于各种生物和非生物样本。在空间和时间特性上精确调整的两束红外激光束可以在不同的波数下产生明亮的CARS图像。将几个CARS滤光器和非扫描检测器组合起来，可以在前向和反向（epi）方向上进行检测。同时，还可以记录二次谐波生成（SHG）。传统扫描仪和高速扫描仪的组合支持以视频速率分析动态过程以及高分辨率的形态学研究。