荧光寿命成像显微镜（FLIM）指南

Amla, Hajira; DeRose, James

Transverse histological cut of a rabbit tongue. 50 Mpixels images (2326 µm x 1739 µm) in 14 x 18 tiles. Lifetime gives an additional contrast that allows to differentiate different structures in histological stainings.

七月 21, 2022

荧光寿命成像显微镜（FLIM）指南

[Translate to chinese:] Transverse histological cut of a rabbit tongue. 50 Mpixels images (2326 µm x 1739 µm) in 14 x 18 tiles. Lifetime gives an additional contrast that allows to differentiate different structures in histological stainings. lms-a-guide-to-flim_header_rabbit-tongue-Fast-FLIM.jpg

荧光寿命成像法

荧光寿命成像显微镜（FLIM）利用荧光染料的固有特性生成图像。荧光分子已成为细胞生物学家的重要工具。荧光分子被广泛应用于显微镜观察细胞、组织甚至整个生物体内的许多不同结构、目标和动态过程。

虽然绝大多数成像实验都是测量荧光强度，但荧光寿命成像利用荧光的另一个关键特性--荧光寿命--为研究增添了丰富的信息来源。荧光染料具有特征发射光谱和荧光寿命，后者反映了染料在激发态下的停留时间。荧光寿命成像图像的对比度取决于荧光信号的寿命而非强度。由于荧光寿命信息取决于染料的微环境，因此可以为实验提供一些有价值的新见解。

直到最近，对于日常显微镜应用，尤其是涉及活细胞成像的应用来说，荧光寿命成像被认为过于缓慢、复杂和昂贵。但这一切正在迅速改变。凭借当今的先进技术，寿命成像比以往任何时候都更快、更容易使用。

寿命信息与荧光团浓度无关，因此荧光寿命成像在研究分子功能、相互作用和环境方面对功能成像非常有用。生物传感器也可利用荧光寿命成像研究细胞微环境。荧光寿命成像可用于区分具有重叠发射光谱的荧光探针，并消除不必要的背景信号。

在本页中，您可以找到关于荧光寿命成像所有问题的指南，并可链接到相关文章以进一步阅读。了解有关荧光寿命成像基础知识的更多信息。

为什么荧光寿命成像和佛斯特共振能量转移是如此完美的组合？

荧光是分子或原子在吸收光后激发的光子的自发发射。如果两个荧光分子（荧光团）距离很近，相隔几个纳米，能量就可以直接从 "供体 "转移到 "受体 "荧光团，而不会发生光发射。这种直接的能量交换被称为佛斯特共振能量转移（FRET）。

佛斯特共振能量转移的发生有几种现象。首先，样品（受体）会发出与所应用的激发颜色不同的荧光。这种发射可以测量并与原始发射进行比较；这种方法被称为 "敏化发射"。敏化发射以可量化的方式表明发生了佛斯特共振能量转移。

在另一方面，由于一些激发态转移到受体的激发态，供体的发射将会减少。这种现象被用于一种称为“受体光漂白”的方法中，通过对受体光漂白后供体发射变化的测量来利用这一现象。受体被移除后，供体的发射将会增加。

荧光染料发射光谱的重叠程度越大，发生荧光共振能量转移（FRET）的可能性就越大。即使分子的方向也会影响能量转移。FRET可用于检测和研究细胞中的分子相互作用，例如配体与受体、蛋白质或效应物和核酸之间的相互作用。

基于强度的FRET方法对样本中荧光染料的浓度变化、分子扩散、样本移动以及激发光波动相当敏感。幸运的是，荧光寿命成像（FLIM）与FRET的结合在克服这些限制时提供了巨大的优势。当发生FRET时，供体的荧光寿命会明显减少，甚至可以用作测量FRET效率的一种方法。有关结合 FLIM 和 FRET 的更多信息。