激光微切割（LMD）促进的分子生物学分析

特别是对于分子生物学分析方法，如定量 PCR，成功的检查依赖于最大精确度和无污染。激光显微切割方法提供的无接触隔离和分离特别适合提取以下结构：

• 来自组织样本的单个细胞；
• 细胞成分；
• 组织区域；
• 染色体；和
• 来自细胞培养的活细胞。

一旦通过激光微切技术成功去除，切割物可以进行分子生物学和生化方法的分析，例如核酸分析和蛋白质研究。特别是，LMD 切割物可以与已建立的分析技术一起使用，如 PCR（聚合酶链反应）、实时 PCR（定量 PCR）、Southern 和 Western 印迹、克隆、以总 RNA 和特定 mRNA 分离形式的 RNA 分析、反转录 PCR、Northern 印迹以及以 2-D SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）、LC-MS（液相色谱质谱）形式的蛋白质分析。

以下更详细地描述了激光显微切割在分子生物学中的应用——涵盖 DNA 和 RNA 分析以及蛋白质组学。除了这些突出的应用，激光显微切割也是细胞培养、植物研究、法医学和气候研究的有效技术。

激光显微切割是提取来自标本的极小样本以进行分子生物学研究的首选方法。在用激光切割目标区域后，可以分离并复制其中包含的核酸。一种称为“芯片实验室”的特殊 PCR 变体在这方面非常有用。

DNA 分析在分子生物学中进行，以澄清医学和诊断问题等事项。它需要在细胞裂解后通过 PCR 变体复制遗传物质。PCR 基于对 DNA 链特定序列部分的特异性扩增原理。激光显微切割与后续 DNA 扩增的一个用途是检测疾病和基因修饰。

在临床医学和分子生物学研究的各个领域，单细胞检查迅速获得了重要性。许多问题只能通过对单个或多个细胞的特定分析以及使用一系列分子生物学方法来回答。激光显微切割在提取和检查单个细胞方面具有特定的目的。

肿瘤学中最大的一个问题是从生长中的肿瘤中的癌细胞选择性地分离 DNA。在早期，受影响的组织区域通常很小，材料也很少。一种解决方案是使用激光显微切割技术预先选择相关细胞，然后将其与健康的周围组织进行分离和比较，以寻找突变的迹象。

使用分子生物学和生化方法对遗传信息进行检查的过程称为基因表达分析。它提供了关于遗传活动的定量和定性信息。微阵列技术在基因组和基因表达分析及诊断中变得越来越普遍。通过这些所谓的基因芯片，可以同时检查许多基因的表达。

激光显微切割用于生成单个或多个相同类型细胞的细胞特异性基因表达谱。激光显微切割在神经科学中发挥着特殊作用，用于从组织中去除单个神经元，特别是将其与周围的胶质细胞分开。这项技术同样成功地用于精确切割轴突或解剖突触。

对于多巴胺研究，重点是对中脑中多巴胺产生神经元的基因表达分析。在帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷/多动症（ADHD）和药物成瘾等疾病模式中，观察到所谓的多巴胺中脑系统的功能障碍。在进行渐进性、选择性细胞损失的情况下（如帕金森病），有必要对健康和病变组织区域中的单个细胞进行分离。

激光显微切割技术使得能够从帕金森病患者的黑质中去除个别受影响的细胞，以及从未受影响的健康对照组织中去除细胞，以便在疾病发展过程中检测这些细胞的基因表达差异。还可以将多巴胺能黑质神经元的基因表达与来自邻近腹侧被盖区的多巴胺能神经元进行比较，后者对帕金森病的脆弱性较低，以找出使神经元更脆弱或更具抵抗力的因素。

蛋白质组学关注蛋白质的结构阐明和定量分析及其相互作用。它提供了代谢途径和调控回路的组成成分的信息。因此，它补充并验证了从基因表达分析中获得的数据。

激光显微切割对于选择和分离细胞以准备蛋白质组分析非常有用。技术，如 MALDI-TOF IMS（基质辅助激光解吸/电离飞行时间成像质谱）或 MALDI-FTICR（傅里叶变换离子回旋共振）IMS，已被应用于药物开发。通过激光显微切割获得的单根人发的纵向切片可以直接使用 MALDI-TOF-IMS 技术进行甲基苯丙胺的检测。

蛋白组学的一个子类别是空间蛋白组学，其中蛋白质丰度与细胞或亚细胞位置相关。特别是，基于人工智能的细胞表型图像分析与自动化单细胞或单核激光显微切割和超高灵敏度质谱结合的深度视觉蛋白组学（DVP）在这里应该被提及 [1]。

使用激光显微切割技术对活细胞进行操作的特殊优势在于可以用激光损伤特定细胞，以观察它们随后的再生。根据研究的重点，也可以使用激光显微切割从活细胞培养中分离选定区域或特定克隆，以便进行进一步培养或额外分析，例如 PCR。

这种方法意味着可以在不受周围环境干扰的情况下检查相关区域。这些技术也适用于细胞手术和类似操作（见下文）。即使是敏感的干细胞，也可以通过激光显微切割进行选择，而不会失去其分裂潜力。这些细胞适用于广泛的研究目的，可用于未来的干细胞治疗、再生医学和药物筛选应用。

在分子水平上研究植物组织面临着巨大的挑战。样本准备中需要克服的主要障碍是植物组织的木质茎和厚细胞壁，相较于动物组织。Leica LMD 系统中使用的激光能够切割甚至是厚重和坚硬的植物材料。通过在不同细胞层次上获取信息，可以更好地理解植物的反应。

在这种情况下，相关问题包括植物组织的发展和分化过程、它们的代谢、适应、疾病的发展和抗逆性。其他有趣的方面包括植物与细菌、病毒、真菌和寄生虫的共生关系和反应。

激光显微切割有助于更清晰地描绘植物细胞。获得的信息可能有助于提高生物量生产，例如，或植物病害控制。激光显微切割还可以用于分离有色叶子色素，以便后续的 NMR 光谱分析。

法医学的一个部分是基因指纹识别，这在今天的许多领域中发挥着关键作用，特别是在犯罪调查中。法医科学家面临的一个特定挑战是样本中各种杂质的存在。通过激光显微切割，现在可以将所需的细胞与杂质分离。还可以通过应用新的细胞识别过程和荧光照明来区分男性和女性细胞。这些细胞可以通过激光显微切割快速识别和分离。

激光显微切割在从涂抹制剂中分离精子方面发挥着特别重要的作用。单个精子细胞被识别、与皮肤细胞和杂质分离，然后进行分析。

细胞生物学中蛋白质和细胞器研究的复杂性日益增加，有时需要结合不同的成像方法。特别是 CLEM 方法将光学显微镜和电子显微镜等技术结合在一起。其主要目标是在电子显微镜的水平上显示光学显微镜图像，即将活细胞中的动态事件与超微结构和三维信息相关联。使用 LMD，可以在培养基表面生成参考坐标系统，以便在样本准备过程中快速准确地确定标记细节的位置。这个过程在图 5 中得到了令人印象深刻的展示。

细菌分析是使用纳米尺度次级离子质谱（NanoSIMS）结合LMD和AFM（原子力显微镜）进行的，以获得显示样本元素和同位素组成的三维图像，空间分辨率为<50 id=2>LMD方法在这里证明是有利的，因为激光在使用的过滤器表面产生网格图案，以标记感兴趣的结构（图 6）。这种方法在海洋生物学中被使用，例如，分析太平洋 [3, 4] 和波罗的海 [5]中的碳和氮固定。

徕卡 LMD 系统在活细胞领域尤其有用，能够故意机械性地破坏细胞结构，如中心体、微管和膜。例如，根据瑞士日内瓦大学遗传医学与发展系的莫妮卡·戈塔教授的说法，激光可以穿透细胞膜，使之前完全被膜阻挡的物质得以渗透。最重要的是，在细胞分裂过程中，可以操控细胞的纺锤体（图 7）。

有关激光显微切割最常见应用的当前论文链接可以在此出版物列表中找到：
https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/p/leica-lmd7/