用SRS显微镜对配方产品进行表征分析

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）能够提供具有高时空分辨率的无标记化学信息，这意味着这些技术非常适合可视化配方产品结构，包括监测单个成分在使用过程中的情况。可以通过从单个成分预先存在的拉曼光谱（图 1，左）中选择适当的拉曼位移来获得 SRS 对比度，或者从通过获取波长扫描生成的 SRS 光谱（见下文以及图 3 中给出的示例）中选择，从而对单个成分进行成像。

除了这些对比波数外，还应该在附近的一个波数上获取一个额外的对照图像，在这个波数上预计不会出现拉曼强度（见图 2 中的示例）。这是为了确保被探测到的信号基于拉曼效应，并能识别出任何异常信号，例如来自激光吸收的伪影。在为每种成分/相在所需波数处获取图像后，可以合并这些图像以构建复合图像，从而能够了解材料中不同成分之间的相关性。除了 SRS 对比之外，通过使用如二次谐波生成或荧光等方法来成像额外的结构信息也是很有用的。图 2 展示的图像揭示了用 SRS 成像的防晒样品中油相与水相的分布，以及使用 SHG 成像技术可视化的氧化锌颗粒分布。

通过执行Lambda扫描，可以生成SRS光谱。在Lambda扫描过程中，以非常小的波长增量捕获SRS图像，以生成涵盖感兴趣波数范围的图像堆栈。视频和图3展示了在药物皮肤制剂上进行的此类Lambda扫描图像堆栈，其中包含多种活性成分。当泵浦光束扫过与拉曼光谱的指纹区域相对应的波长时，不同的成分会依次被激发，因为它们的波数被刺激。一旦获取了这一堆栈图像，就可以选择特征来生成感兴趣区域（ROI）。通过绘制ROI的SRS信号强度与泵浦光束的波长（可以转换为波数）的关系，生成SRS光谱。有时，生成波长堆栈中所有图像的最大投影可以帮助可视化所有特征在一个单一图像中，确保没有遗漏重要特征。

一旦通过波长扫描生成了 SRS 光谱，就可以将其与单个成分的自发拉曼光谱进行比较。光谱信息与图像中的形态信息相结合，可以为配方故障排除提供有价值的工具，例如识别多晶型物、共晶体或氧化产物的存在。

除了表征配方本身之外，SRS 也是一个出色的工具，可用于可视化单个成分在应用后的情况。例如，监测化学物质渗透到皮肤中具有极其重要的应用，尤其是在药物输送和化学风险评估方面。图4展示了用4-氰基苯酚给皮肤涂抹后的图像。将组织进行冷冻切片，并使用SRS成像，以利用2235 cm⁻¹处的氰基官能团（品红色）的对比度来显示该化合物的分布。使用2850 cm⁻¹处的CH2伸缩振动模式（红色）可视化皮肤结构；使用1666 cm⁻¹处的酰胺I（蓝色）；以及使用SHG通道（绿色）显示胶原蛋白分布。

由于SRS信号与浓度呈线性关系，因此可以通过图像分析提取一定程度的定量信息，例如，化学物种在皮肤深度中的相对浓度。对于在同一共焦平面中成像的物理横截面，这相对简单直接。然而，在成像3D样本时，必须对由于激光光散射和吸收导致随着深度增加的信号损失进行校正。

在尝试成像不包含与组织不同的独特化学官能团的化学物种时，有时很难获得特定的对比度。在这种情况下，对感兴趣的分子进行氘化处理有助于将峰值转移到拉曼光谱的生物“静默”区域，在该区域中组织中的信号很少或没有。这种方法可以提供一种方便的工具，以便在不引入会干扰物理化学性质和因此的药代动力学的荧光团的情况下，进行敏感且化学特异的可视化。或者，可以采用多元数据分析方法来对不同成分进行光谱解混。

我们衷心感谢“分析化学信托基金”和“分析测量科学社区”的支持。

*数据是与英国巴斯大学理查德·盖伊教授团队合作获得的。本研究得到了美国食品和药物管理局通过（1U01FD006533-01）资助的部分支持。本研究的观点不一定反映卫生与公共服务部的官方政策；提及的任何商标名、商业惯例或组织均不意味着美国政府的认可。