荧光活细胞成像技术

保持样本处于生理条件下：

进行实验时，最需要考虑的一点是在样本制备和成像过程中保持样本的活力和健康。 因此，至关重要的是将样本保持在尽可能接近生理条件（即温度、 pH值、氧气含量及其他重要因素）的环境中。

尽可能减少曝光产生的光胁迫：

将活细胞暴露于光线下会导致光毒性和样本生理机能变化，因此您获得的结果可能与健康生物体的实际情况不符。 为了尽可能避免光毒性，宽视场显微镜通常是活体样本成像的首选技术。 它们用较低的 LED 光剂量照射样本以激发荧光团，而且成像速度快于其他显微成像方法，如共聚焦成像。

标记样本：

对活体样本成像时，如果要标记发生所研究事件的样本结构，荧光蛋白通常是首选工具，因为与其他标记相比，这类蛋白的毒性通常较低，并且避免了抗体不能进入细胞的问题。 荧光蛋白技术采用基因编码的荧光团，该荧光团可用于跟踪活细胞中标记的生物分子及其相互作用等。 同时使用多种荧光蛋白（称为多色或多通道成像）可以同步观察多个细胞结构和过程，提供更具生理学意义的结果，从而为测量数据增加相关信息（例如使用其他标志物进行活细胞/死细胞实验，或进行多色囊泡观察实验）。 阅读本文，进一步了解如何在活体样本中进行多色成像。多通道活细胞成像注意事项。

用于活细胞成像的显微成像技术有很多种。 通常，使用复合显微镜以及相差和微分干涉差(DIC)等方法长时间观察细胞生长、细胞聚合或细胞运动。 大型样本（如发育中的斑马鱼胚胎）的延时成像通常使用体视显微镜或宏观显微镜进行。
本文重点介绍过去几十年来日益重要的荧光显微成像技术。 这个简短的概述中介绍了常用的定量方法，以及常用于宽视场显微镜的光操控技术。

由于细胞溶质中的离子成分决定了许多关键功能，例如神经元的兴奋性、基因转录和细胞运动等，因此，在空间和时间两个方面调节细胞内离子是生命科学研究的主要关注点。 离子成像（钙、氯化物、镁）是一种常用的方法，使用专门设计的荧光染料或蛋白，这类物质在与钙结合时会改变其发射特性。 这使研究人员能够观察细胞中离子浓度的动态变化。 此外，还可以用特殊的荧光染料对细胞内 pH 水平或电压进行成像。 一种专门用于检测离子水平、pH水平或电压变化的技术是比率成像。 这是能够准确测定细胞内变化（例如细胞内钙浓度）的一组方法，而不是像在非比率方法中那样监测相对变化。

全内反射荧光(TIRF)是一种特殊技术，用于观察细胞质膜内或附近发生的事件。 通过使用仅穿透细胞内60-250纳米的荧光色素激发消逝场，TIRF 显微镜可提供无与伦比的Z方向分辨率，从而能够对细胞质膜内或附近发生的事件（例如分子转运至质膜）成像。 TIRF可避免被来自细胞内更深层分子发出的荧光信号淹没的问题。
TIRF图像： 沿着肌动蛋白丝转运靠近膜的半乳凝素-3囊泡。

荧光共振能量转移(FRET)属于一组光操控技术，让您能够通过光线与样本中所观察的事件交互。
FRET是用于量化分子动力学的有用工具，例如蛋白质间相互作用、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质构象变化。 FRET成像通常使用GFP（绿色荧光蛋白）的衍生物，特别是CFP和YFP（分别为青色和黄色荧光蛋白），这些衍生物通过分子生物学方法被分别附加到感兴趣的蛋白质上。 然后用荧光激发CFP分子。 一旦感兴趣的蛋白质在空间上互相靠近（<20纳米），CFP就会作为供体通过发射光的形式将能量传递给作为受体的YFP。 研究人员就会观察到从CFP发出的蓝色荧光变为从YFP发出的黄色荧光。 在BRET（生物发光共振能量转移）中，荧光供体是生物发光分子（如荧光素酶衍生物），而GFP衍生物则是受体，就像FRET中一样。

光漂白后荧光恢复(FRAP)是另一种常用于监测蛋白质或囊泡转运的光操控技术。 FRAP将荧光蛋白（通常为GFP）附加到感兴趣的蛋白上，也就是要监测其运动的蛋白。 通常情况下，最初整个细胞都会发出荧光，因为整个细胞中可能富含蛋白质。 然后，将细胞某个区域（通常具有类似于神经元细胞轴突或树突的细胞结构）暴露于高强度的光下，以消除（漂白）该特定区域中的荧光。 感兴趣的蛋白质移动时，会以一定的速度出现在漂白区域，使用该区域恢复的荧光信号可以追踪这些蛋白，使研究人员能够深入了解细胞内转运动力学。

光活化是最近开发出的一种方法，通过使用专门设计的染料，例如光活化绿荧光蛋白(paGFP)或 Kaede，选择性地标记细胞或生物体中感兴趣的区域。 这些染料只有在特定波长的光照下才发出明显的荧光。 这些染料还可与感兴趣的蛋白质融合，然后使用FRAP或颗粒跟踪方法研究蛋白质的表达或转运动力学。

活细胞成像是生命科学研究中不可或缺的工具，可使细胞在尽可能接近体内状态的环境下成像。 通过采集活细胞图像，您可以全面理解和研究有关细胞运动、生长和动态过程的问题。

生物研究已从单纯的描述性研究进入一个定量分析时代。 新的活细胞成像技术在朝着更高的空间和时间分辨率的方向发展。 技术发展现在专注于动态事件的定量研究，因此这些方法更容易使用，对于全面解答研究问题必不可少。